Tecniche di micromanipolazione che consente analisi delle dinamiche morfogenetiche e fatturato dei regolatori del citoscheletro

L'obiettivo generale dell'utilizzo di una combinazione di tecniche di micromanipolazione e microscopia ottica come FRAP e fotoattivazione è quello di monitorare la dinamica spaziotemporale delle proteine coinvolte nella regolazione e nella migrazione del citoscheletro in condizioni distinte o in modo dipendente dalla via di segnalazione. I metodi di micromanipolazione qui discussi sono utili per la consegna diretta di qualsiasi tipo di molecola nelle cellule, nonché per una manipolazione indotta dalla luce dell'attività proteica all'interno di posizioni subcellulari definite. Quindi il vantaggio principale delle tecniche qui presentate è che consentono di determinare gli effetti istantanei che le proteine esercitano sulle cellule insieme al monitoraggio della loro mobilità in tutta la cellula.

Per iniziare questa procedura, è stato fatto passare le cellule B16-F1 precedentemente coltivate in un rapporto di uno a cinque in un piatto di plastica di tre centimetri. Aspirare il terreno di coltura cellulare. Lavare le cellule con PBS, aspirare il PBS e aggiungere tripsina EDTA per staccare le cellule.

Aggiungere il terreno di coltura cellulare alle cellule tripsinizzate. Risospendere e trasferire le cellule in provette di falco, dopo questa centrifuga a 1000 giri/min per tre-cinque minuti. Dopo aver posizionato le cellule B16-F1 in un piatto di tre centimetri e averle lasciate diffondere per almeno sei ore, trasfettare le cellule B16-F1 aggiungendo una miscela di 500 nanogrammi di costrutto di DNA e un microlitro di reagente di trasfezione in una soluzione contenente 150 millimolari di cloruro di sodio.

Per le cellule B16-F1 rivestire vetrini coprioggetti da 15 millimetri con 150 microlitri di soluzione di laminina e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Per le cellule NIH 3T3, rivestire i vetrini coprioggetti con una soluzione di fibronectina e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare i vetrini di copertura incubati con laminina e fibronectina con PBS, quindi aspirare il PBS.

Seminare due millilitri di fibroblasti NIH 3T3 in rapporto da uno a 20 da un piatto confluente sui vetrini di copertura rivestiti di fibronectina. Pipet due millilitri di cellule B16-F1 trasfettate in un rapporto da uno a 30 da una piastra confluente sui vetrini di copertura rivestiti di laminina. Successivamente, consentire alle cellule di diffondersi su vetrini di copertura rivestiti di laminina e fibronectina durante la notte in un incubatore di coltura tissutale a 37 gradi Celsius prima della microscopia.

Posizionare il vetro di copertura con le celle rivolte verso l'alto su una camera di imaging in alluminio RC-26 termoconduttivo. Quindi posizionare un sigillante di plastica sopra il vetro di copertura per creare una tenuta sicura tra il vetrino di copertura e la camera, fissare avvitando il sigillante di plastica con il scorrevole clamps della camera per evitare perdite di fluido. Ora, pipettare il terreno per microscopia preriscaldato a 37 gradi Celsius nell'area centrale.

Inserire il rilevatore di calore nell'apposita fessura della camera e collegare gli elettrodi della camera a un regolatore di temperatura automatico TC-324B mantenendo una temperatura costante di 37 gradi Celsius. Centrifugare una soluzione proteica precedentemente scongelata a 10.000 G per almeno 30 minuti per rimuovere gli aggregati proteici che possono portare all'ostruzione dell'ago se presenti nel capillare di microiniezione. Utilizzando una punta di pipetta flessibile, caricare un ago per microiniezione con un microlitro di soluzione proteica dal lato posteriore.

Se sono presenti bolle d'aria nella punta dell'ago, picchiettare delicatamente la base dell'ago per rimuoverle. Quindi regolare con cautela il supporto dell'ago sul dispositivo di micromanipolazione. Dopo aver avvitato l'ago per microiniezione nel supporto dell'ago, applicare pressione sull'ago utilizzando un dispositivo a pressione per microiniezione prima di traslocare la punta dell'ago nel terreno di coltura cellulare.

Quindi, posiziona l'ago nel campo visivo utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento, quindi trova una cella di interesse e abbassa gradualmente l'ago sopra la cella. Per la microiniezione, toccare delicatamente la membrana plasmatica della cellula, che può essere sufficiente per penetrare nella cellula o favorire la rottura transitoria della membrana con un tocco molto delicato sulla configurazione del microscopio. Arrestare il processo di iniezione non appena il flusso nella cellula è visibile spostando la punta dell'ago verso l'alto nel terreno.

Prima di attivare il laser, passare al canale GFP e avviare l'acquisizione time lapse dell'immagine. Successivamente, disegnare manualmente la regione da sbiancare sul canale GFP durante la visualizzazione del display. Avviare il fotobleaching con un trigger manuale del laser a 405 nanometri almeno tre o quattro fotogrammi dopo l'inizio dell'acquisizione dell'immagine.

Impostare l'acquisizione dell'immagine GFP 488 nanometro nel software su un'esposizione di 500 millisecondi e un intervallo di tempo di 1500 millisecondi. Quindi, regolare le impostazioni del software per l'acquisizione di filmati time lapse a doppio o triplo canale contrassegnando il quadrato della serie di lunghezze d'onda e selezionando il numero di canali desiderato nel menu di acquisizione della lunghezza d'onda. Prima di attivare il laser, avviare l'acquisizione time-lapse dell'immagine e disegnare manualmente la regione da fotoattivare sul canale di contrasto di fase durante la visualizzazione del display.

Successivamente, avviare la fotoattivazione mediante un trigger manuale del laser a 405 nanometri, almeno tre o quattro fotogrammi dopo l'inizio dell'acquisizione dell'immagine. Per l'analisi dei risultati FRAP, aprire i filmati time lapse derivati da VisiView sul software MetaMorph. Ricava i valori di intensità delle regioni fotosbiancate per ogni punto temporale di recupero della fluorescenza disegnando manualmente le rispettive regioni utilizzando MetaMorph.

Disegna una forma sulla punta del lamellipodio che copra l'intera o parte dell'area fotosbiancata e regola manualmente la sua posizione sui fotogrammi successivi, se necessario, al fine di tenere traccia dei cambiamenti nelle intensità lamellipodiali della rispettiva regione nel tempo durante lo spostamento della punta in avanzamento. Per la correzione dello sfondo e l'acquisizione del fotosbiancamento, analizzare rispettivamente le regioni all'esterno e all'interno delle cellule. Una volta selezionata una regione di interesse, estrai i suoi valori di intensità su MetaMorph utilizzando il menu misura le misure della regione.

Assicurarsi che le opzioni di tempo trascorso e intensità media siano selezionate nel menu di configurazione. Fare clic su Apri registro e selezionare Scambio dinamico di dati. Quindi fare clic su OK per aprire un foglio di calcolo Excel e fare nuovamente clic sul pulsante Apri registro per incollare i valori MetaMorph in Excel.

Utilizza i valori di intensità derivati da MetaMorph per calcolare le curve di recupero della fluorescenza FRAP incollando i valori di intensità in un foglio di calcolo Excel contenente le formule appropriate. Il recupero della fluorescenza della regione fotosbiancata viene normalizzato allo sfondo e alle regioni interne. Per calcolare il tempo di metà del recupero della fluorescenza, incollare i valori delle curve di recupero della fluorescenza con i tempi corrispondenti in SigmaPlot, quindi eseguire un adattamento della curva utilizzando lo strumento di aumento esponenziale al massimo della procedura guidata di adattamento dinamico, selezionando la funzione mono o bi-esponenziale a seconda del miglior adattamento della curva.

I parametri ottenuti risolvendo la funzione selezionata possono essere incollati in un foglio di calcolo excel contenente la formula appropriata che consente di calcolare il rispettivo tempo di recupero in secondi. Per misurare la diffusione dell'actina fotoattivabile dopo l'attivazione, nonché il suo accumulo all'interno di una regione specifica, come il lamellipodium, utilizzare MetaMorph per determinare le intensità nel tempo nelle rispettive regioni, così come all'esterno della cellula, al fine di determinare la fluorescenza di fondo per la normalizzazione. Per esaminare il tasso preciso di spostamento dell'actina fotoattivabile lontano dalla regione di attivazione o il suo tasso di incorporazione all'interno del lamellipodio, generare curve di fluorescenza da dati precedentemente derivati da MetaMorph.

Incolla i valori di intensità per la regione di sfondo utilizzata per la normalizzazione, la regione citosolica fotoattivata o la regione lamellipodiale da studiare in un foglio di calcolo excel contenente le formule appropriate. Qui sono mostrate immagini di contrasto facciale di una cellula di fibroblasti NIH 3T3 prima e dopo la microiniezione della piccola GTPasi Rac1. A circa 12 minuti dalla microiniezione, la cellula ha cambiato la sua morfologia, il che indica il successo dell'iniezione.

Il riciclaggio di EGFP VASP sbiancato da molecole non sbiancate sulla punta del lamellipodium è mostrato qui. In questo particolare esempio, la fluorescenza di recupero si stabilizza a circa l'80% della fluorescenza prima dello sbiancamento. Dopo la fotoattivazione, l'actina GFP fotoattivata si diffonde rapidamente fuori dalla regione citosolica.

Una frazione di monomeri di actina fotoattivati si trasloca nella parte anteriore, creando una rapida esplosione di fluorescenza nei lamellipodi. L'incorporazione della fluorescenza è deliziosamente più bassa nei lamellipodi distanti dalla regione fotoattivata poiché la frazione di monomeri di actina fotoattivati viene diluita con monomeri non attivati nel loro viaggio attraverso il citosol. Poiché l'actina GFP fotoattivata si diffonde lontano dalla regione fotoattivata nel tempo, viene continuamente sostituita da actina non fotoattivata e non fluorescente.

Di conseguenza, si osserva una graduale diminuzione dell'intensità della fluorescenza di questa regione. Nel corso del tempo, i lamellipodi vicini alla regione di attivazione citosolica incorporano rapidamente l'actina fluorescente. Il successivo calo della fluorescenza è semplicemente dovuto alla depolimerizzazione dell'actina e alla diffusione del monomero lontano dal lamellipodio.

Quindi, quando gli esperimenti vengono eseguiti su un singolo sistema di microscopia, la combinazione di microiniezione e tecniche FRAP o di fotoattivazione può realisticamente essere eseguita nel giro di pochi minuti, a seconda della natura delle proteine studiate. Ricordate sempre di mantenervi felici prima, durante e dopo la micromanipolazione o dopo l'esposizione alla luce laser. Per la FRAP e la fotoattivazione è particolarmente importante che la regione selezionata mantenga la propria integrità strutturale per tutta la durata del film.

La procedura di microiniezione può essere completata dall'applicazione locale di farmaci permeabili alla membrana plasmatica o di inibitori del citoscheletro al fine di affrontare le conseguenze immediate di determinati trattamenti a livello subcellulare. Le tecniche di micromanipolazione hanno aperto la strada allo studio delle proprietà di diffusione e delle dinamiche subcellulari dei componenti e dei complessi citoscheletrici e alla comprensione dei percorsi di seconda mano che regolano la morfogenesi cellulare. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come tracciare e monitorare le dinamiche spazio-temporali delle proteine citosoliche, delle proteine incorporate nell'atto all'interno del citoscheletro o che risiedono in diversi organelli subcellulari, svelando infine la cinetica della regolazione cellulare.