Un test Engulfment: un protocollo per valutare le interazioni tra sistema nervoso centrale fagociti e neuroni

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare e quantificare l'inghiottimento degli input presinaptici da parte della microglia. Ciò si ottiene iniettando prima i traccianti fluorescenti di grado anteriore negli occhi per marcare gli input presinaptici delle cellule gangliari retiniche nel nucleo genificale laterale. Il secondo passo è sezionare, fissare ed equilibrare il cervello.

Successivamente, il cervello viene sezionato. Il passaggio finale consiste nel montare le sezioni cerebrali su un labbro di copertura per l'imaging e l'analisi. In definitiva, la microscopia confocale viene utilizzata per valutare l'inghiottimento degli input presinaptici da parte della microglia.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come ad esempio come i terreni fagocitici contribuiscono alla plasticità e al rimodellamento dei circuiti sinaptici. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul rimodellamento dei circuiti sinaptici nel cervello sano, può essere applicato anche ad altri sistemi come il rimodellamento dei circuiti sinaptici durante le malattie del sistema nervoso. A dimostrare la procedura saranno Chris Heller, un tecnico, ed Emily Laman, una studentessa laureata dello Stevens Laboratory.

Iniziare questa procedura anestetizzando un topo con fluoro ISO al 4% in una camera di induzione in plexiglass. Dopo uno o tre minuti, assicurarsi di raggiungere un livello adeguato di anestesia pizzicando la coda. Quindi posiziona il mouse su un fianco sotto lo stereomicroscopio e posiziona il cono del naso, che eroga dal 3 al 4% di fluoro ISO sul muso.

Per esporre la sclera, usa un paio di piccole forbici a molla per aprire la palpebra e tirare indietro la pelle. Per i neonati, a volte è necessario un altro taglio perpendicolare all'angolo dell'occhio. Fai attenzione quando tagli l'angolo della palpebra poiché c'è un vaso sanguigno.

Utilizzare un ago sterile calibro 30,5 per praticare un piccolo foro sul lato dell'occhio dove inizia la sclera. Fare attenzione a non danneggiare la lente inserendo l'ago quel tanto che basta in modo che lo smusso entri nell'occhio. Lasciare che il vitreo fuoriesca dal foro e utilizzare un taglio sterile e un applicatore con punta per assorbire il liquido.

Una volta che il vitreo ha smesso di fuoriuscire dal foro, inserire lentamente un ago con estremità smussata collegato a una siringa di Hamilton che è stata precaricata con tracciato di grado anteriore. Colorare nel foro, iniettare lentamente il colorante nell'occhio. Tipicamente, la subunità beta della tossina del colera coniugata ad Alexa 5 94, 6 47 o 4 88 viene utilizzata per il grado anteriore.

Input GC R traccia in ritardo Lasciare l'ago nel foro per alcuni secondi e poi rimuoverlo lentamente. Utilizzare un applicatore con punta di cotone per assorbire il liquido in eccesso ed evitare che il colorante fuoriesca. Quindi applicare una piccola quantità di unguento antibiotico sull'occhio.

Se l'occhio è stato aperto chirurgicamente. Riposizionare delicatamente le palpebre dopo l'iniezione. Lascia il mouse sotto una lampada riscaldante o su un termoforo fino a quando non inizia a riprendersi dall'anestesia.

Rimetti il topo in una gabbia domestica pulita e monitoralo per assicurarti che sia completamente sveglio prima di riportarlo alla colonia. Circa 24 ore dopo l'iniezione, sacrificare il topo e sezionare il cervello. Fissa il cervello in un tubo Falcon riempito con il 4% di PFA durante la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo.

Sciacquare il cervello tre volte in PBS versando prima il cervello e il PFA in una barchetta di siero di latte vuota, quindi utilizzare la spatola per trasferire il cervello in un'altra barchetta di siero di latte piena di PBS. Lavare il cervello altre due volte in PBS prima di trasferirlo in una provetta Falcon riempita con una soluzione di saccarosio al 30%. Lasciarlo nel saccarosio a quattro gradi Celsius fino a quando non affonda sul fondo del tubo.

Successivamente, rimuovi tutte le parti del cervello che non sono necessarie con una lama di rasoio. Congela il cervello su un foglio di alluminio su ghiaccio secco. Nel frattempo, congelare lo stadio del microtomo e riempire ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti con mezzo millilitro di PP molare da 0,1 per montare il cervello congelato sullo stadio di congelamento.

Applicare una piccola quantità di OCT sullo stage. Una volta che l'OCT inizia a congelarsi, adagiatevi il cervello. Il lato del cervello che verrà tagliato dovrebbe essere rivolto verso l'alto.

Quindi, copri il cervello e l'OCT con ghiaccio secco tritato molto finemente. Lasciare il ghiaccio secco sul cervello per circa 30 secondi. Quindi utilizzare un pennello grande per rimuovere il ghiaccio secco.

Iniziare a sezionare le fette a 40 micron di spessore. Quindi utilizzare un piccolo pennello umido per rimuovere le sezioni contenenti la regione di interesse dalla lama e trasferirle sulla piastra a 24 pozzetti contenente 0,1 pb molare. Una volta raccolte le sezioni, visualizzare l'etichettatura del grado anteriore con un microscopio da dissezione a fluorescenza e scegliere le sezioni che contengono la regione di interesse per montare le sezioni su un vetrino.

Innanzitutto, applicare un piccolo pool di 0,1 molari di PB a un microscopio carico. Far scorrere successivamente, trasferire le sezioni di tessuto nel pool di pb. Quindi usa il pennello per orientare e stendere i tessuti.

Usa una salvietta Kim per rimuovere XSPB e fai attenzione a evitare di allontanare la sezione. Lasciarli asciugare completamente all'aria. Quindi applicare una piccola goccia di mezzo di montaggio su ciascuna sezione e montare un vetrino coprioggetti sulla parte superiore all'estremità.

Sigillare i bordi del vetrino con lo smalto per unghie. Conservare il vetrino a meno 20 gradi Celsius fino alla sessione di imaging visualizzata. Ecco uno schema della strategia di tracciamento del grado anteriore.

Gli ingressi RGC dell'occhio sinistro e destro sono tracciati rispettivamente con CTB 6 47 e CTB 5 94. Successivamente viene valutato l'inghiottimento degli input mediato dalla microglia. Ecco un'immagine rappresentativa a basso ingrandimento del DLGN del topo postnatale del quinto giorno dopo il tracciamento intergrado degli input dell'occhio sinistro e destro.

Si tratta di una microglia campionata dalla regione di confine degli input dell'occhio sinistro e destro. Tutta la fluorescenza di CTB al di fuori del volume microgliale è stata sottratta rivelando gli input RGC che sono stati inghiottiti e la resa superficiale della microglia e inghiottita. Gli ingressi RGC sono mostrati qui.

Ecco la microglia resa in superficie rappresentativa da topi P cinque, P nove e P 30. DLGN L'inghiottimento degli input RGC è significativamente aumentato durante il picco di potatura nel DLGN rispetto alle età più avanzate. Le microglia di topi carenti nel recettore del complemento tre inghiottono significativamente meno input di RGC rispetto ai compagni di cucciolata di tipo selvatico Una volta padroneggiato.

Questa tecnica può essere eseguita in 72 ore se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come intergradare i neuroni marcati e valutare le interazioni delle sinapsi della microglia.