Name: Un test Engulfment: un protocollo per valutare le interazioni tra sistema nervoso centrale fagociti e neuroni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-08T23:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Scopri un saggio di engulfment per studiare l'interazione tra microglia e neuroni nel sistema nervoso centrale. Questo metodo quantitativo utilizza traccianti fluorescenti e microscopia confocale per analizzare la fagocitosi sinaptica.

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Il lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della Fondazione Famiglia Smith (BS), Dana Foundation (BS), John Merck Scholars Program (BS), NINDS (RO1-NS-07100801, BS), NRSA (F32-NS-066698; DPS), Nancy Lurie Marks Foundation (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Imaging Core).

1. Anterograda Etichettatura di RGC presinaptici ingressi Nota: Tutti gli esperimenti che comportano l&#39;uso di animali sono stati esaminati e supervisionate dalla cura degli animali e l&#39;uso comitato istituzionale (IACUC) in conformità a tutte le direttive NIH. <ol><li> Sterilizzare campo e gli strumenti. </li><li> Anestetizzare mouse con 4 vol% isoflurano in una camera di induzione plexiglas (questa vol% isoflurano lavora per topi neonati-adulti). Osservare i topi strettamente per evitare un eccesso di anestetizzante. ATTENZIONE: Evitare l&#39;inalazione con una evacuazione dei gas di scarico sotto vuoto. </li><li> Dopo 1-3 minuti, (topi anziani richiedono meno tempo) garantire un adeguato livello di anestesia viene ottenuta pizzicando la coda (senza reazione dovrebbe essere osservato) e osservando la frequenza respiratoria (tasso dovrebbe essere lento e costante). </li><li> Posizionare il mouse sotto il microscopio stereo su un lato e posto ogiva consegna 3-4 vol% isoflurano sul muso (neonati &lt;giorno postnatale 10 (P10) ~ 4% vol;&gt; P10 ~ 3% vol). </li><li> Esporre la sclera. Per l&#39;iniezione dei neonati prima di aprire gli occhi, usare un paio di piccole forbici a molla per aprire la palpebra e tirare indietro la pelle per esporre la sclera. Per i topi più anziani, usare le dita per tirare indietro la pelle che circonda l&#39;occhio per esporre la sclera. ATTENZIONE: Nei neonati, a volte un altro taglio perpendicolare all&#39;angolo dell&#39;occhio è necessario. Fate attenzione quando si taglia l&#39;angolo della palpebra in quanto vi è un vaso sanguigno che, se tagliato, si sanguinare eccessivamente. </li><li> Utilizzare una sterile 30,5 G dell&#39;ago per perforare un piccolo foro nel lato dell&#39;occhio nella riga dove inizia la sclera. Fate attenzione a non danneggiare la lente inserendo l&#39;ago quanto basta che lo smusso va nell&#39;occhio. </li><li> Lasciare il vitreo di fuoriuscire dal foro e utilizzare un applicatore con punta di cotone sterile per assorbire il liquido. </li><li> Una volta che il vitreo si è smesso di scorrere fuori dal buco, inserire un ago ended smussato attaccato ad una siringa Hamilton precaricato con anterograda tracciamento colorantenel foro. Attenzione: inserire l&#39;ago lentamente per evitare la puntura all&#39;altro lato dell&#39;occhio o danneggiare la lente. </li><li> Lentamente iniettare colorante nell&#39;occhio. Tipicamente, tossina colerica subunità β coniugato con Alexa 594, 647, o 488 (CTB-594, CTB-647, o CTB-488, 5-6 mg / mL) viene utilizzato per anterogradely ingressi RGC traccia. Per i neonati (≤ P10) 1-2 microlitri è sufficiente e per i topi&gt; P10 ~ 3 ml è sufficiente. Nota: coloranti Alexa sono particolarmente resistenti alla degradazione lisosomiale </li><li> Lasciare l&#39;ago nel foro per alcuni secondi e poi rimuovere lentamente. </li><li> Usare un applicatore con punta di cotone per assorbire il liquido in eccesso e prevenire la tintura di fuoriuscire. </li><li> Applicare una piccola quantità di pomata antibiotica per l&#39;occhio. Se l&#39;occhio è stato aperto chirurgicamente, riposizionare delicatamente le palpebre insieme. </li><li> Se l&#39;iniezione entrambi gli occhi, ripetere la procedura su altro occhio. </li><li> Dopo iniezione (s), lasciare mouse sotto una lampada di calore o su un tappetino di calore fino a quando non comincia a recuperare dal AnesthESIA. </li><li> Ritorno mouse per una gabbia casa pulita e controllare per assicurarsi che sia completamente sveglio prima di tornare alla colonia. </li></ol> 2. Preparare Tissue Imaging Questo protocollo di preparazione dei tessuti viene utilizzato per topi transgenici in cui i fagociti sono etichettati con marcatori fluorescenti (ad esempio, CX3CR1-EGFP per microglia). Se una linea giornalista non è disponibile, il ricercatore può immunostain sezioni di tessuto (vedi discussione). <ol><li> ~ 24 ore dopo l&#39;iniezione, sacrificare il mouse e sezionare il cervello. </li><li> Goccia fissare il cervello in un tubo Falcon riempito con 4% paraformaldeide (PFA) notte a 4 ° C. ATTENZIONE: PFA è tossico. Evitare l&#39;inalazione e l&#39;esposizione della pelle utilizzando in una cappa aspirante o su un tavolo downdraft e indossare dispositivi di protezione individuale. Note: Fissazione può essere più breve (≥ 4 ore). Inoltre, invece di fissaggio goccia, 4% PFA perfusione può essere utilizzata seguito da una correzione 2-24 hr goccia. Tuttavia, il confronto di nei profumid far cadere il cervello neonatale e adulti fissi rivelato alcuna differenza nella qualità dell&#39;immagine o la quantificazione. </li><li> Sciacquare i 3x cerebrali in tampone fosfato (PBS). <ol><li> Versare il cervello e PFA in un peso barca vuota. </li><li> Utilizzare una spatola per trasferire il cervello ad un altro pesare barca piena di PBS. </li><li> Lavare cervello altre due volte in PBS (cervello trasferimento ad altri due pesare barche piene di PBS). </li></ol></li><li> Trasferire il cervello di un tubo Falcon riempito con una soluzione di saccarosio al 30%. Lasciare il cervello in saccarosio a 4 ° C fino al cervello scende sul fondo della provetta (24-48). </li><li> Una volta che il cervello affonda, preparare il cervello per il sezionamento. Le seguenti operazioni sono la preparazione di 40 sezioni micron mobile usando un microtomo a slitta con una fase di congelamento (un criostato può anche essere utilizzato). <ol><li> Utilizzare una lama di rasoio per rimuovere le parti del cervello che non sono necessari (per la dLGN, rimuovere le parti rostrale e caudale del cervello). </li><li> Congelare il reggisenoin su un foglio di alluminio in ghiaccio secco. Durante questo tempo, congelare la fase microtomo e riempire ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti con 0,5 ml di tampone fosfato 0,1 M (PB). </li></ol></li><li> Montare il cervello congelato (dovrebbe apparire opaco) sul palco di congelamento. <ol><li> Applicare una piccola quantità di mescola ottimale temperatura di taglio (OCT) per lo stadio. </li><li> Una volta che l&#39;ottobre comincia a congelare, porre il cervello in ottobre La fine del cervello che sarà tagliata deve essere rivolto verso l&#39;alto (ad esempio, per il dLGN, rivolta verso la parte caudale up). </li><li> Coprire il cervello e ottobre con ghiaccio secco molto finemente tritato. </li><li> Lascia ghiaccio secco sul cervello / ottobre per ~ 30 sec. </li><li> Utilizzare un grande pennello per rimuovere il ghiaccio secco. Il cervello e ottobre devono essere congelati allo stadio. </li></ol></li><li> Iniziare sezionamento attraverso il tessuto fino a raggiungere la regione di interesse (ROI). </li><li> Una volta raggiunta la ROI, utilizzare un piccolo pennello per rimuovere sezioni dalla lama e trasferirli alla piattaforma 24 pozzettie contenente 0,1 M PB (passo 2.5.2). Mantenere il pennello umido bagnando nel 0,1 M PB prima di rimuovere sezioni dalla lama. Nota: Le sezioni possono essere lasciati in 0.1 M PB notte a 4 ° C. </li><li> Una volta che le sezioni sono stati raccolti, visualizzare l&#39;etichettatura anterograda sotto un microscopio a fluorescenza dissezione e scegliere le sezioni che contengono il ROI. </li><li> Montare le sezioni su un vetrino con un piccolo pennello. <ol><li> Applicare una piccola piscina di 0,1 M PB ad un vetrino da microscopio carica. </li><li> Trasferire la sezione di tessuto al pool di PB. </li><li> Utilizzare il PB e pennello per orientare e diffondere il tessuto. </li><li> Utilizzare un Kimwipe per favorire l&#39;eccesso PB. Fare attenzione ad evitare traspirazione fuori la sezione. </li><li> Lasciare asciugare completamente. </li><li> Applicare una piccola goccia di soluzione di montaggio per ogni sezione e montare un coprioggetto sulla parte superiore (22 x 50 mm, No. 1.5). </li><li> Sigillare i bordi di scorrimento con smalto e conservare a -20 ° C fino sessione di imaging. Nota: Anche se di imaging conin una settimana di preparazione è consigliata, vetrini possono essere mantenuti a -20 ° C per diverse settimane prima di imaging. </li></ol></li></ol> 3. Tissue Imaging Tutte le immagini sono acquisite su un disco rotante microscopio confocale (UltraView Vox disco rotante microscopio confocale equipaggiato con laser a diodi (405 nm, 445 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm e 640 nm)). Le immagini possono anche essere acquisite su qualsiasi microscopio con la capacità di acquisire ad alta risoluzione Z-stack (ad esempio, scansione laser microscopio confocale, microscopio epifluorescente seguita da deconvoluzione, ecc). Dimensione del frame è tipicamente 1.000 x 1.000 pixel. <ol><li> Trova ROI a 10X di ingrandimento e di acquisire un&#39;immagine. Per l&#39;imaging microglia nel sistema retinogeniculate, il ROI è sezioni dLGN più mediale. </li><li> Passaggio a più alto ingrandimento (obiettivo 60X Plan Apo, NA = 1.4, viene di solito utilizzato). </li><li> Acquisire primo campo visivo contenente fagociti utilizzando 0,2 micron z-passos. </li><li> Acquisire 15-19 più campi contenenti fagociti per animale. </li></ol> 4. Preparare Immagini per Quantificazione (ImageJ) <ol><li> Aperto z-stack in ImageJ. </li><li> Vai al menu Immagine, selezionare il colore e canali di Spalato. </li><li> Sottrarre sfondo dal canale (s) contenente il materiale inghiottito. <ol><li> Selezionare la finestra del canale contenente il materiale inghiottito (ad esempio, ingressi presinaptici). </li><li> Vai al menu Processo e selezionare Sfondo Sottrai. Utilizzare un raggio palla di 10 pixel per anterograda tracciamento degli ingressi presinaptici nel dLGN. Nota: Il raggio palla viene determinata empiricamente. Tuttavia, dovrebbe generalmente essere grande come il raggio del più grande oggetto nell&#39;immagine che non fa parte dello sfondo. </li></ol></li><li> Smooth il canale contenente la fagociti. <ol><li> Selezionare la finestra contenente il canale fagociti (ad esempio, microglia). </li><li> Vai al menu Processo e select Filtri, intendo. Utilizzare un filtro medio di 1,5 (questa leviga l&#39;immagine per il rendering di superficie in fasi successive). </li></ol></li><li> Sottrarre da sfondo il canale contenente la fagociti. <ol><li> Selezionare la finestra contenente il canale fagociti (ad esempio, microglia). </li><li> Vai al menu Process, selezionare sfondo sottrarre (impostazioni dovranno essere empiricamente determinato). Utilizzare un raggio palla di 50 pixel per microglia EGFP-positivi. </li></ol></li><li> Unisci canali andando al menu Immagine e selezionando colori, unione Canali. </li><li> ROI Crop contenente fagocita da file unito (questo rende la superficie di rendering più veloce, punto 5). <ol><li> Tracciare un riquadro intorno al ROI utilizzando lo strumento di selezione rettangolare nella barra degli strumenti. </li><li> Vai al menu Image e selezionare Ritaglia. </li></ol></li><li> Split nuovamente i canali (vedi punto 4.2). </li><li> Salvare ogni canale come file TIFF. </li></ol> 5. Preparare Immagine per la quantificazionein Imaris <ol><li> Aprire Imaris e fare in modo che l&#39;icona del volume è selezionato nel menu in alto a sinistra (Figura 2). </li><li> Aperto primo canale immagine ritagliata di (uno qualsiasi dei canali può essere aperto prima, basta essere coerenti). </li><li> Aggiungere l&#39;altro canale (s). Vai al menu Modifica, selezionare Aggiungi canali e selezionare il canale successivo nel file. (Ripetere questo passaggio per tutti i rimanenti canali). Nota: Per cambiare il colore, andare alla finestra di regolazione del display e fare clic sul nome del canale (Figura 3A). Si aprirà una finestra di dialogo per regolare il colore. Se la finestra di regolazione del display non è visibile, andare al menu Modifica e selezionare Regolazione visualizzazione. </li><li> Regolare i valori dei pixel. Vai al menu Modifica e selezionare Proprietà immagine. In questa finestra, regolare x, y, z ed i valori dei pixel (Questi valori dipendono dal microscopio, obiettivo, fotocamera e acquisizione z-passo e possono essere trovati nel software utilizzato per acquisire l&#39;immagine). </li><li> Fase 5.5 si tradurrà in unpiccola. Per ridimensionare, fare clic sull&#39;icona Fit nell&#39;angolo in basso a destra (Figura 2). </li><li> Nella finestra di regolazione del display, regolare la luminosità e il contrasto per ciascun canale utilizzando i triangoli sinistro e centrale. </li></ol> 6. 3 dimensioni (3D) Rendering Superficie del Fagocita <ol><li> Nella barra degli strumenti in alto, assicurarsi che la modalità Superare è selezionato (Figura 3C). </li><li> Nella finestra di Regolazione visualizzazione, deselezionare tutti i canali eccetto il canale fagociti. Questo rimuoverli dal campo visivo. </li><li> Fare clic sull&#39;icona di rendering di superficie (Figura 2). </li><li> Una finestra creare verrà visualizzata nella parte sinistra in basso (Figura 4A), assicurarsi di settore ROI è deselezionata in questa prima finestra. Fare clic sul pulsante blu in avanti in basso. </li><li> Regolare il livellamento. <ol><li> Nella finestra successiva, scegliere il canale phagocyte dal menu a discesa (Figura 4B). Consente di regolare laquantità di dettagli che verranno a galla e dovrebbe essere determinato in modo empirico (0,1 micron smoothing viene in genere utilizzato per microglia). </li><li> Selezionare soglia assoluta. </li><li> Fare clic sul pulsante blu in avanti in basso. </li></ol></li><li> Threshold l&#39;immagine. <ol><li> Clicca su istogramma e trascinare fino immagine è emerso in modo appropriato (Figura 4C). Questo è determinato empiricamente ruotando l&#39;immagine di garantire le superfici grigie sovrapposta all&#39;immagine fluorescente sono una rappresentazione accurata superficie. Note: Per ruotare, selezionare Naviga nel menu puntatore sul lato superiore destro dello schermo (Figura 3B), cliccare e tenere premuto l&#39;immagine da ruotare. Per tornare sull&#39;immagine per orientamento originale, selezionare Fondo Origine sinistra dal menu Visualizza. </li><li> Fare clic sul pulsante blu in avanti in basso. </li></ol></li><li> Nella finestra successiva, c&#39;è la possibilità di filtrare tutte le superfici in base alle dimensioni, ecc Se l&#39;immagine è molto rumoroso, non filtrare ed eliminare unI filtri y che appaiono automaticamente. Fare clic sulla freccia verde in basso per terminare superficie rendering del fagociti. Apparirà una nuova serie di schede (Figura 5) </li><li> Se necessario, eliminare eventuali superfici che non fanno parte del fagociti di interesse. <ol><li> Assicurarsi che l&#39;opzione Select è selezionato nel menu Pointer (Figura 3B). </li><li> Clicca su qualsiasi superficie da eliminare in modo che diventa giallo. Per eliminare più superfici, fare clic sulle superfici tenendo premuto il pulsante di controllo. </li><li> Fare clic su Elimina nella scheda Pencil. </li></ol></li><li> Selezionare e unire tutte le superfici del fagocita in una superficie. <ol><li> Clicca sul Funnel (ie scheda Filtro, Figura 5C). </li><li> Fare clic su Aggiungi. </li><li> Scegliere qualsiasi filtro, trascinare l&#39;istogramma all&#39;estrema sinistra (tutte le superfici devono essere di colore giallo). </li><li> Torna alla scheda Matita e fare clic su Unify. </li></ol></li><li> Vai alla scheda grafico (Figura 5A </strong&gt;) e fare clic su Dettagli e selezionare i parametri da visualizzare. Selezionare il volume (Figura 5D). Per la visualizzazione di più parametri, andare sull&#39;icona della chiave inglese in basso a sinistra (Figura 2) e di selezionare i parametri da registrare. </li><li> Registrare il volume del phagocyte e salvare il file prima di continuare. </li></ol> 7. Rendering 3D Surface di Engulfed Materiale <ol><li> Creare un nuovo canale per il materiale che è stato travolto dal fagociti. <ol><li> Mentre è selezionata la superficie dei fagociti, fare clic sulla scheda matita. </li><li> Fare clic su Maschera tutto. </li><li> Nella finestra di dialogo che appare, selezionare il canale corrispondente al materiale inghiottito (ad esempio, anterograda tracciamento degli ingressi presinaptici; la figura 5B). </li><li> Controllare canale duplicato prima di applicare la maschera e premere OK. </li><li> Un nuovo canale apparirà nella finestra di regolazione del display che contiene solo il materiale che è stato travolto ed è all&#39;interno delphagocyte. </li></ol></li><li> Rendere la superficie del canale che contiene materiale Engulfed e nonengulfed totale. <ol><li> Deselezionare tutti i canali nella finestra di regolazione del display, tranne per il canale da asfaltata e deselezionare la superficie creata per il phagocyte. </li><li> Fare clic sull&#39;icona di rendering di superficie di nuovo (vedi punto 6.3) e creare una superficie per il canale utilizzando gli stessi passi descritti per la fagociti (passaggi 6,4-6,11). Note: Assicurarsi di selezionare il canale corretto prima di rasare e soglia (punto 6.5, figura 4B). Prendere nota del valore di soglia (vedere il punto 6.6; Figura 4C). Questo valore può essere ottenuto anche dopo il rendering superficie è completa (scheda bacchetta; Figura 5A). </li></ol></li><li> Registrare il volume del materiale totale inghiottito e non travolto e salvare il file prima di continuare. </li><li> Render superficie del materiale fagocitato (materiale all&#39;interno del fagociti). <ol><li> Visualizza fluorescenza soloil nuovo canale di materiale travolto (vedi punto 7.2.1). </li><li> Seguire la stessa procedura come sopra (passi 7,2-7,3). Note: Assicurarsi di selezionare il canale corretto dal menu a discesa prima di rasare (scegliere il nuovo canale creato nel passaggio 7.1). Nella finestra di soglia, immettere manualmente il valore di soglia che è stato impostato per il rendering del materiale totale inghiottito e non travolto (vedi punto 7.2.2). </li></ol></li><li> Registrare il volume del materiale inghiottito e salvare il file prima di continuare. </li></ol> 8. Calcola il volume totale del campo visivo <ol><li> Creare una nuova superficie per ogni canale. </li><li> Nella finestra thresholding (passo 6.6), far scorrere l&#39;istogramma completamente verso sinistra in modo che l&#39;intero campo è emerso. </li><li> Termina emersione l&#39;intero campo e registrare il volume (passaggi 6,7-6,11). </li><li> Salvare il file. </li></ol> 9. Calcolare la quantità di materiale fagocitati <ol><li> Calcolare la densità deltotale canale materiale inghiottito e non inghiottito utilizzando il seguente algoritmo: Volume di Total Engulfed e non Engulfed Material (punto 7.3) / Volume del campo (punto 8). </li><li> Calcola% fagocitazione per cella utilizzando il seguente algoritmo: (Volume di Engulfed Material (punto 7.5) / Volume totale Fagocita (punto 6.11)) x 100 Note: per tenere conto di variazioni nelle dimensioni delle cellule, i dati vengono normalizzati per il volume totale della fagociti. Se i numeri di passo 9.1 sono molto variabili tra i campi, può essere necessario normalizzare i dati dal punto 9.2 al calcolo in 9.1. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Al fine di misurare con precisione la fagocitosi, materiale inghiottito deve essere etichettato in modo tale che il ricercatore può visualizzare una volta è verificato degradazione lisosomiale. Inoltre, è necessaria imaging ad alta risoluzione, seguito dall&#39;uso di software che permetterà al ricercatore di visualizzare il volume dell&#39;intera cella e quantificare il contenuto. In questo protocollo, si descrive un metodo altamente affidabile e quantitativo per la misurazione fagocitazione phagocyte-mediata con CTB c...

<html> Circuiti sinaptici rimodellare tutta la vita di un animale. Nel cervello in via di sviluppo, le sinapsi si formano in eccesso e devono subire la potatura sinaptica che comporta la rimozione selettiva di un sottoinsieme di sinapsi e la manutenzione e il potenziamento di quelle sinapsi che rimangono 8-10. Questo processo è necessario per conseguire la connettività precisa caratteristica del sistema nervoso adulto. Nell&#39;adulto, sinapsi possono anche essere di plastica, in particolare nel contesto di apprendimento e memoria. Le correlazioni strutturali di questa plasticità si pensa di includere l&#39;aggiunta e / o l&#39;eliminazione delle spine dendritiche e boutons presinaptici 11-13. Oltre a questi ruoli nel sistema nervoso sano, rimodellamento sinaptico è anche coinvolto nella nervoso 12,14,15 malattia del sistema / infortunio. Ad esempio, a seguito di lesioni del midollo spinale, gli assoni mozzate successivamente devono rimodellare e formare nuove sinapsi per raggiungere funzionale 16-19 recupero. nt &quot;&gt; Emergendo come un aspetto importante della plasticità sinaptica è il processo di fagocitosi o fagocitazione delle sinapsi destinati per la rimozione 3,5,20. Abbiamo recentemente dimostrato questo fenomeno nel contesto della potatura sinaptica nel sano, postnatale cervello di topo 7. particolare , microglia, i residenti del SNC cellule immunitarie e fagociti, sono stati mostrati per inghiottire ingressi presinaptici nel corso di un periodo di picco e in una regione di sviluppo di potatura sinaptica, la postnatale dorsale nucleo genicolato laterale (dLGN) del talamo. blocco genetica o farmacologica di questa fagocitazione portato a disavanzi sostenuti nella connettività sinaptica. In questo protocollo, si descrive un test affidabile e altamente quantitativo per misurare fagociti-mediata fagocitazione degli ingressi presinaptici. Ai fini del presente articolo, questo saggio sarà presentato nel contesto del sistema di sviluppo retinogeniculate, che comprende le cellule gangliari retiniche (RGC) residenti nella retina cheproiettare ingressi presinaptici al dLGN (Figura 1A). Per iniziare, un anterograda strategia etichettatura degradazione resistente lisosomiale sarà descritto, che viene utilizzato per visualizzare RGC-specifici ingressi presinaptici nel dLGN (Figura 1) 7,21. A seguito di questa descrizione, una metodologia dettagliata per l&#39;imaging e misurare quantitativamente fagocitazione usando la microscopia confocale in combinazione con 3 dimensioni (3D) della superficie volume rendering sarà dato. Questa metodologia si basa sulla preparazione del tessuto fisso, ma può anche essere adattato per l&#39;utilizzo in studi di imaging dal vivo. È importante sottolineare che, mentre il test è stato convalidato nel contesto del sistema retinogeniculate sano, postnatale, si potrebbe applicare le stesse tecniche per valutare altre interazioni fagociti neuroni in tutto il cervello e durante la malattia, così come la funzione dei fagociti in altri organi.

<table><tbody><tr><td>Termoforo</td><td>Vet Equip, Inc.</td><td>965500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fonte di acqua calda per termoforo</td><td>Kent Scientific</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>DSC Optical</td><td>Zeiss Opmi -6 Microscopio</td><td></td>chirurgico</tr><tr><td>Microtomo scorrevole con tavolino di congelamento</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td>Lama per microtomo</td><td>Leica</td><td>14021607100</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione fluorescente</td><td>Nikon</td><td>SMZ800 con Microscopio</td><td></td></tr><tr><td>confocale a disco rotante</td><td>Perkin Elmer</td><td>UltraView Vox Disco rotante confocale</td><td></td></tr><tr><td>10 &; l Siringhe a tenuta di gas</td><td>Hamilton Hamilton</td><td>80030</td><td>Utilizzare una siringa diversa per ogni colorante/tracciante</td></tr><tr><td>Aghi Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>7803-05, specifiche: smussato, tossina</td> del colera coniugata Alexa da 1,5" <td></td></tr><tr><td>e subunità beta (CTB)</td><td>Invitrogen</td><td>488: C22841</td><td>Ricostituire in soluzione fisiologica sterile, 80 &; l (488), 100 & micro; l (594), 20 &micro; l (647)</td></tr><tr><td>594: C22842</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>647: C34778</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato&nbsp;( PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>Neomicina e polimixina B solfati e bacitracina Zinco Unguento oftalmico USP (unguento antibiotico)</td><td>Bausch & Lomb</td><td>24208-780-55</td><td></td></tr><tr><td>Ago da 30,5 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla</td><td>Roboz</td><td>RS-5630</td><td></td></tr><tr><td>Applicatore con punta in cotone</td><td>Fisher</td><td>23-400-125</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeyde (PFA)</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>15710</td><td>Diluire dal 16% al 4% in PBS. La paraformaldeide è tossica, utilizzare in una cappa aspirante e indossare dispositivi di protezione individuale.</td></tr><tr><td>Strumenti di dissezione &ndash; forbici, pinze, spatola</td><td>Forbici piccole: Fine Science Tools</td><td>Forbici piccole: 14370-22</td><td></td></tr><tr><td>Forbici grandi: Roboz</td><td>Forbici grandi: RS-6820</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#55 pinze: Fine Science Tools</td><td>#55 pinze: 11255-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spatola: Ted Pella, Inc.</td><td>Spatola: 13504</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S8501-5KG</td><td>Produce il 30% di saccarosio in PBS (peso/volume)</td></tr><tr><td>OCT Composto</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Pesa USA</td><td>Scientific</td><td>2347-1426</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 24 pozzetti</td><td>BD Biosciences</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico</td><td>Sigma</td><td>S6566-500G</td><td>Produrre 0,2 M di fosfato di sodio monobasico (PB-A) in ddH2O e 0,2 M di fosfato di sodio bibasico (PB-B) in ddH2O. Per ottenere 0,1 M di PB, combinare 19 ml di PB-A e 81 ml di PB-B, riempire fino a 200 ml con ddH2O</td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5136-500G</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti, 22 X 50 mm, n. 1.5</td><td>VWR</td><td>48393 194</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per microscopio carico</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Vectasheild</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

un test engulfment: un protocollo per valutare le interazioni tra sistema nervoso centrale fagociti e neuroni

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

La fagocitosi è un processo in cui una cellula avvolge materiale (intera cella, parti di una cellula, detriti, ecc) nel suo ambiente extracellulare circostante e successivamente digerisce questo materiale, comunemente mediante degradazione lisosomiale. Microglia sono le cellule immunitarie residenti del sistema nervoso centrale (CNS) la cui funzione fagocitica è stata descritta in una vasta gamma di condizioni di malattia neurodegenerativa (es. pallone beta-amiloide nella malattia di Alzheimer) allo sviluppo del cervello sano (ad esempio, sinaptica potature) 1-6. Il protocollo che segue è un test fagocitazione sviluppato per visualizzare e quantificare microglia-mediata fagocitazione degli ingressi presinaptici nel sistema retinogeniculate topo in via di sviluppo 7. Mentre questo test è stato utilizzato per valutare la funzione microglia in questo particolare contesto, un approccio simile può essere utilizzato per valutare altri fagociti tutto il cervello (ad esempio, astrociti) e il resto del corpo(ad esempio, macrofagi periferici) nonché altri contesti in cui avviene il rimodellamento sinaptico (ad esempio, il trauma cranico / malattia).

Recentemente, abbiamo utilizzato questo test fagocitazione per visualizzare e quantificare microglia-mediata fagocitazione degli ingressi presinaptici nel sistema retinogeniculate in via di sviluppo (Figura 1) 7. RGC da CX3CR1-EGFP topi eterozigoti sono stati rintracciati anterogradely con CTB-594 e CTB-647 negli occhi sinistro e destro rispettivamente. A seguito di tale tracciato, microglia EGFP-positivi all&#39;interno del dLGN sono stati ripresi. Queste immagini sono state successivamente ...

Microglia sono le cellule immunitarie residenti del sistema nervoso centrale (CNS) con una elevata capacità di fagocitare o fagocitare materiale nel loro ambiente extracellulare. Qui, un saggio largamente applicabile, affidabile e altamente quantitativa per la visualizzazione e la misurazione microglia-mediata fagocitazione dei componenti sinaptiche è descritto.

Un test Engulfment: un protocollo per valutare le interazioni tra sistema nervoso centrale fagociti e neuroni

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare e quantificare l'inglobamento degli input presinaptici da parte dei microglia. Questo viene ottenuto innanzitutto iniettando traccianti fluorescenti anterogradi negli occhi per etichettare gli input presinaptici delle cellule gangliari retiniche nel nucleo genicolato laterale. Il secondo passaggio consiste nel dissezionare, fissare ed equilibrare il cervello.Successivamente, il cervello viene sezionato. L'ultimo passaggio consiste nel montare le sezioni cerebrali su un'ansa di copertura per l'acquisizione di immagini e l'analisi. Infine, la microscopia confocale viene utilizzata per valutare l'inglobamento degli input presinaptici da parte dei microglia.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, come il contributo dei fagociti alla plasticità e al rimodellamento dei circuiti sinaptici. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul rimodellamento dei circuiti sinaptici nel cervello sano, può essere applicato anche ad altri sistemi, come il rimodellamento dei circuiti sinaptici durante le malattie del sistema nervoso. A illustrare la procedura saranno Chris Heller, un tecni

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Questo articolo descrive un nuovo protocollo e reagenti impostare progettato per la misura sensibile degli effetti neurotossici di composti e trattamenti sulla co-culture di neuroni e astrociti utilizzando l'analisi ad alto contenuto. Risultati dimostrano che l'analisi ad alto contenuto rappresenta una tecnologia entusiasmante romanzo per la valutazione neurotossicità.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

Questo studio descrive le procedure di creazione di un nuovo assone neuronale e (astro) glia co-coltura piattaforma. In questo sistema di co-coltura, la manipolazione di interazione diretta tra un singolo assone (e singole cellule gliali) diventa possibile, consentendo l'analisi meccanicistica del neurone reciproco segnalazione gliali.

Analisi Imaging di Neuron Interaction Glia in Platform Cultura Microfluidic (MCP) a base di Axon neurone e glia co-cultura di sistema

In questo video, eseguiamo il test di fagocitosi microgliale per il neuroblastoma utilizzando cellule staminali pluripotenti indotte. Il test aiuta a valutare la compromissione della funzione microgliale nelle malattie neurodegenerative.

Saggio di fagocitosi microgliale: un test in vitro per stabilire un modello di fagocitosi microgliale per le cellule di neuroblastoma utilizzando i macrofagi iPSC

In questo video, valutiamo la capacità fagocitaria di astrociti purificati in vitro mediante test di imaging dal vivo. Il test funge da efficace piattaforma di screening per identificare i composti chimici che possono migliorare o inibire la capacità fagocitaria degli astrociti.

Saggio di fagocitosi in vitro: un metodo basato sull'imaging dal vivo per studiare la fagocitosi sinaptosomica mediata da astrociti in tempo reale

Fonte: Funes, S., et. al., Cellule simili alla microglia umana: differenziazione da cellule staminali pluripotenti indotte e saggio di fagocitosi su cellule vive in vitro utilizzando sinaptosomi umani. J. Vis. Exp. (2022)Questo video mostra un test per studiare la capacità fagocitaria di cellule simili alla microglia utilizzando sinaptosomi marcati con coloranti fluorescenti sensibili al pH.

Saggio di fagocitosi su cellule vive di cellule simili alla microglia utilizzando sinaptosomi umani

fagocitosi microglia è fondamentale per il mantenimento della omeostasi tissutale e fagocitaria inadeguata è stato implicato nella patologia. Tuttavia, valutare la funzione microglia in vivo è tecnicamente impegnativo. Abbiamo sviluppato una tecnica semplice ma robusto per monitorare e quantificare il potenziale di fagocitosi microglia in un ambiente fisiologico preciso.

La valutazione della retina microglia fagocitaria Funzione<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando un test citometria a flusso basato su

Questo protocollo descrive l'indiretta co-coltura di neuroni-astrociti per l'analisi compartimenti stagni delle interazioni neuroni-glia.

La indiretto Neuron-astrociti co-coltura saggio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up per l&#39;indagine dettagliata delle Interazioni neuroni-glia

Questo protocollo presenta un in vitro live-imaging test di fagocitosi per misurare la capacità fagocitica dei astrocytes. Microglia e astrociti di ratto purificati vengono utilizzati insieme a sinaptosomi coniugato con indicatore di pH. Questo metodo in grado di rilevare in tempo reale engulfment e degradazione cinetica e fornisce una piattaforma di screening adatto per identificare i fattori che influenzano la fagocitosi di astrociti.

Un romanzo In Vitro Live-imaging dosaggio del Astrocyte-mediata fagocitosi utilizzando pH indicatore-coniugato sinaptosomi

Le malattie neurodegenerative sono associate a funzioni microglia disregolate. Questo articolo delinea un test in vitro della fagocitosi delle cellule di neuroblastoma da parte dei macrofagi iPSC. Le lettura quantitative al microscopio sono descritte sia per l'imaging time-lapse a cellule vive che per l'imaging ad alto contenuto a cellule fisse.

Test di imaging quantitativo in vitro per la fagocitosi delle cellule morte del neuroblastoma da parte di iPSC-Macrophages

Qui presentiamo due protocolli per quantificare l'inghiottimento microgliale delle sinapsi vGLUT1-positive e dei sinaptosomi grezzi marcati con pHRodo Red utilizzando la citometria a flusso.

Quantificazione dell'inghiottimento microgliale di materiale sinaptico mediante citometria a flusso

Scopri un saggio di engulfment per studiare l'interazione tra microglia e neuroni nel sistema nervoso centrale. Questo metodo quantitativo utilizza traccianti fluorescenti e microscopia confocale per analizzare la fagocitosi sinaptica.

Un test Engulfment: un protocollo per valutare le interazioni tra sistema nervoso centrale fagociti e neuroni

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