Microscopia a due fotoni per lo studio dell'attrazione del processo microgliale verso un composto in una fetta di cervello di topo

Posizionare una fetta di cervello di topo in una camera di perfusione contenente aCSF sotto un microscopio a due fotoni.

Il topo è geneticamente modificato per esprimere la GFP nella microglia, consentendo il tracciamento del movimento microgliale.

Fissare la fetta con un supporto.

Utilizzando l'illuminazione a campo chiaro, individuare la regione di interesse.

Passare all'illuminazione a fluorescenza per visualizzare la microglia.

Riempire una micropipetta con il composto in esame, montarla su un supporto per siringa e abbassarla fino a toccare la fetta.

Attiva la modalità di imaging a due fotoni, concentrando la luce del vicino infrarosso a bassa energia nel tessuto.

Nel punto focale del laser, due fotoni combinano la loro energia per eccitare la GFP, emettendo fluorescenza.

Acquisisci immagini su più piani Z per concentrarti sui processi microgliali.

Registrare l'attività di base, quindi iniettare il composto e continuare la registrazione.

Il composto si lega ai recettori microgliali, innescando vie di segnalazione che guidano l'estensione del processo microgliale verso la fonte del composto.

Monitorare l'aumento della fluorescenza vicino al sito di iniezione nel tempo per tracciare il movimento.

30 minuti Prima di iniziare la registrazione, collega la pompa peristaltica a una camera di registrazione personalizzata con perfusione superiore e inferiore per ottimizzare l'ossigenazione e la vitalità delle fette di tessuto e pulisci l'intero sistema di perfusione con 50 millilitri di acqua ultrapura. Al termine del ciclo di pulizia, avviare la perfusione della camera di registrazione con 50 millilitri di aCSF in un becher di vetro a carbogenazione costante e utilizzare una pipetta di trasferimento monouso a bocca larga per trasferire la prima fetta da visualizzare nel becher per rimuovere la carta per lenti.

Quando la sezione è affondata sul fondo del bicchiere, trasferisci la sezione nella camera di registrazione e posiziona il supporto della fetta sulla fetta per ridurre al minimo il movimento indotto dal flusso di perfusione. Usa l'illuminazione a campo chiaro per mirare alla regione del cervello di interesse con un ingrandimento da 5 a 10 volte. Quindi utilizzare un obiettivo 25x con una lente a immersione in acqua 0,35x per regolare la posizione del campo di osservazione.

Usa l'illuminazione a fluorescenza per localizzare le cellule microgliali fluorescenti e riempi la pipetta con 10 microlitri di aCSF contenente il composto di interesse alla sua concentrazione finale. Puntare il puntale verso il basso agitando delicatamente per rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate nel puntale e montare la pipetta riempita in un portapipette collegato a una siringa da 5 millilitri, con uno stantuffo posizionato nella posizione di 5 millilitri e montato su un micromanipolatore a tre assi.

Abbassa delicatamente la pipetta verso la fetta, controllando e regolando l'obiettivo allo stesso tempo, fino a quando la punta della pipetta tocca leggermente la superficie della fetta. Ora sintonizza il laser e passa il microscopio alla modalità multifotone. Assicurarsi che la camera sia schermata da qualsiasi fonte di luce e accendere i rilevatori non descansionati. Imposta il guadagno e utilizza una tabella di ricerca con un limite superiore codificato a colori per evitare di saturare i pixel nell'immagine.

Quindi inizia a registrare per una durata totale di almeno 30 minuti, premendo lentamente lo stantuffo della siringa dalla posizione di 5 a 1 millilitro dopo cinque minuti per un periodo di 5 secondi per applicare il composto alla sezione. Per l'analisi delle immagini, eseguire prima la proiezione Z e la correzione della deriva con ImageJ sul file di interesse. Quindi apri il file modificato in Icy e disegna una regione di interesse circolare di 35 micrometri di diametro centrata sul sito di iniezione.

Esegui di nuovo il filmato con il ROI per assicurarti che sia ben posizionato. Quindi, utilizza il plug-in Intensity Evolution della regione di interesse per misurare l'intensità media nel tempo nella regione di interesse e salvare i risultati come file .xls.