Determinazione della membrana plasmatica di partizionamento per marginalmente-associated Proteins

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia cellulare, tra cui lo svelamento delle vie di segnalazione cellulare. Quindi il vantaggio principale di questa tecnica è che in realtà non richiede alcun approccio microscopico sofisticato. È anche molto veloce e quindi utilizzabile per l'osservazione in tempo reale della distribuzione delle proteine nelle cellule.

La valutazione e la quantificazione del partizionamento di membrana di proteine associate perifericamente è complicata a causa della diffrazione della luce che provoca un mescolamento della membrana plasmatica e della fluorescenza citoplasmatica al microscopio. Iniziare questa procedura con la preparazione del materiale biologico come descritto nel protocollo di testo. Colorare il materiale preparato con il colorante FM 4-64 applicando un protocollo di colorazione appropriato per il materiale studiato.

Per le cellule di tabacco BY-2, colorare 200 microlitri di sospensione cellulare con 0,2 microlitri di soluzione FM 4-64 da 10 millimolari in dimetilsolfossido. Per catturare una sezione confocale equatoriale per una cellula, impostare una scansione sequenziale a due canali per il cromoforo utilizzato come tag proteico e per FM 4-64. Imposta anche una risoluzione ottica più alta.

Un esempio di configurazione è un obiettivo a immersione in olio 63x con un'apertura numerica di 1,3 e una dimensione dell'immagine di 1.024 x 1.024 pixel. Installare Fiji ImageJ Distribution e la periferica macro richiesta. Nelle Figi, selezionare i plug-in, quindi le macro, quindi l'installazione nel menu principale e specificare il percorso del file scaricato con la periferica macro ImageJ.

Installare il software R Project e i pacchetti necessari. Esegui l'interfaccia utente grafica R, seleziona i pacchetti, quindi installa i pacchetti nel menu principale e specifica il repository più vicino e il pacchetto ggplot2 per l'installazione. Scaricare la periferica R Package.

Installarli selezionando i pacchetti, quindi installare i pacchetti dai file locali. Elaborare le immagini confocali del marcatore citoplasmatico. Per fare ciò, importa le immagini nelle Figi utilizzando i plug-in, quindi i bioformati, quindi l'importatore di bioformati dal menu Figi con le impostazioni predefinite.

Eseguire la macro delle opzioni di importazione per un'impostazione di analisi. Attiva la macro selezionando la stessa voce dopo aver fatto clic sullo strumento menu delle proteine periferiche. Definite il valore appropriato nel campo pixel del raggio di sfocatura gaussiana.

Ciò influenza l'uniformità dell'immagine e la riduzione del rumore. Un valore basso è sufficiente e non causa alcuna perdita di informazioni sull'immagine. Ora imposta un valore nel pixel di larghezza della linea del profilo del campo.

Una linea più spessa provoca una maggiore levigatura delle curve del profilo. Si consiglia un valore predefinito di 10 pixel. Imposta un titolo per l'immagine, analizzando in base alla definizione dei delimitatori di esempio e degli elementi esportati.

Fare clic su OK. Controllare l'analisi del titolo nella finestra di dialogo successiva e fare clic su OK o Indietro per ripristinare. Successivamente, eseguire una selezione lineare attraverso la regione della membrana plasmatica nelle immagini elaborate e misurare i profili di fluorescenza. A tale scopo, selezionare la linea retta dello strumento Figi dalla barra degli strumenti Figi.

Fare clic sull'immagine e trascinare una linea attraverso la regione della membrana plasmatica. La linea deve iniziare nello spazio extracellulare e deve essere perpendicolare alla membrana plasmatica. Scegli regioni con uno strato più spesso e omogeneo di citoplasma corticale.

La lunghezza ottimale della selezione lineare è compresa tra cinque e 10 micron. Eseguire la macro del profilo di presa facendo clic sullo strumento del profilo di presa nella barra degli strumenti delle Figi. Verrà eseguita la misurazione automatica dei profili di fluorescenza in entrambi i canali e i dati verranno visualizzati nella finestra dei risultati.

In base alla variabilità del segnale individuale, prendere numeri rappresentativi dei profili per ciascuna cella. Eseguire la macro di dati del profilo del grafico per la visualizzazione grafica dei profili misurati. Impostare il parametro nella finestra di dialogo della macro richiamata.

Mantenere deselezionata la casella di controllo Usa filtro per i dati di input. Specificare se il grafico deve essere creato dai dati recenti nella finestra dei risultati, da un singolo file CSV o da tutti i file CSV in una directory specificata facendo clic sul pulsante di opzione appropriato. Specificare i fattori di raggruppamento da utilizzare per il plottaggio selezionando le caselle di controllo appropriate.

Selezionare il fattore I se tutti i profili devono essere visualizzati in grafici univoci. Mantenere deselezionate le caselle di controllo se tutti i dati devono essere tracciati in un unico grafico. Fare clic su OK. Specificare il percorso e il nome del file per il salvataggio dei risultati o per l'eventuale importazione dei dati nella finestra di dialogo successiva.

Confermare l'analisi facendo clic su OK nelle finestre di dialogo, che mostrano il codice R eseguito. Eseguire la macro di impostazione del filtro dei profili se alcuni profili tracciati hanno segnali eccessivi nello spazio extracellulare o intracellulare. Seguire impostando i parametri nella finestra di dialogo della macro richiamata.

Per ogni canale, impostare la soglia di intensità appropriata nel file, rimuovere le misurazioni con un segnale extracellulare o intracellulare eccessivo. Specificare la regione in cui verrà applicata la soglia di intensità nel campo in corrispondenza di coordinate X inferiori o maggiori di, quindi fare clic su OK. Eseguire nuovamente la macro di dati del profilo di stampa con la casella di controllo Usa filtro per l'input dei dati selezionata. Ora aggiungi i dati dal file salvato in precedenza.

Assicurati che tutti i profili aberranti siano stati rimossi correttamente, altrimenti migliora i parametri di filtraggio. Eseguire la macro di creazione del modello per creare un modello della membrana plasmatica e della distribuzione della fluorescenza del citoplasma in base ai dati di calibrazione. Dopo aver impostato i parametri nella finestra di dialogo della macro richiamata come descritto nel protocollo di testo, fare clic su OK. Specificare il percorso e il nome del file di input nelle finestre di dialogo successive e confermare l'analisi facendo clic su OK nella finestra di dialogo che mostra il codice R eseguito.

Successivamente, elabora le immagini delle cellule che esprimono la proteina di interesse. Importa le immagini e imposta l'analisi come prima. L'arrotondamento e la larghezza della linea dovrebbero essere identici.

Procedere alla misurazione dei profili. Verificare l'accuratezza dei profili tracciando e, se lo si desidera, impostare il filtro come descritto in precedenza. Eseguire la macro di calcolo della distribuzione per il calcolo di una partizione proteica tra la membrana plasmatica e nel citoplasma.

Specificare i dati di input e le origini del modello ed eventualmente impostare un filtro dei dati. Mantenere la casella di controllo attivata per rimuovere i risultati con variabilità residua maggiore rispetto a quando si desidera un filtro dei risultati. Specificare la soglia della variabilità residua massima consentita che può essere inspiegata dalla scomposizione del segnale della singola misurazione del profilo.

Selezionare i fattori di raggruppamento del campione, che possono essere utilizzati per creare un box plot. Fare clic su OK, specificare i percorsi di input o output e confermare l'analisi facendo clic su OK nella finestra di dialogo che mostra il codice R eseguito. Qui è mostrata un'immagine di una cellula colorata con FM 4-64 che esprime una proteina vegetale, che è associata alla membrana plasmatica tramite N-miristoilazione e interazione elettrostatica con fosfoinositidi.

Queste interazioni sono state disturbate sperimentalmente dalla wortmannina. L'importanza della N-miristoilazione è stata testata mediante mutazione nella glicina sulla seconda posizione dell'amminoacido che funge da sito di N-miristoilazione. L'effetto della rimozione di entrambe le capacità di legame con la membrana plasmatica è stato testato mediante troncamento del dominio N-terminale della proteina.

Il box plot risultante mostra una diminuzione dell'affinità della membrana plasmatica dopo la mutazione del sito di N-miristoilazione e dopo il trattamento farmacologico. Il loro effetto reciproco è paragonabile all'effetto della rimozione del dominio N-terminale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire le fasi principali dell'analisi in un ordine corretto e di come impostare i loro parametri.

A seguito di questa analisi, è possibile eseguire un metodo statistico come l'ANOVA per la valutazione statistica dei dati ottenuti. Sebbene questo metodo sia stato sviluppato per le cellule in sospensione vegetale, può essere applicato anche ad altre cellule o tessuti con membrane plasmatiche lisce e chiaramente distinguibili.