Microscopia di localizzazione a singola molecola delle proteine di membrana utilizzando la marcatura a singolo anticorpo

La mia ricerca si concentra sulla membrana delle cellule T e mira a rivelare nuove intuizioni su scala nanometrica rilevanti per il targeting terapeutico. I metodi di imaging esistenti di solito non visualizzano direttamente le interazioni anticorpo-epitopo su scala nanometrica nelle cellule. Questo protocollo supera questa limitazione consentendo l'osservazione diretta all'interno dell'ambiente cellulare.

Dopo aver montato il campione sul microscopio e depositato i colloidi d'oro sulla superficie, si utilizza l'illuminazione in campo chiaro per verificare che siano stati depositati abbastanza colloidi nella regione di interesse. Verifica che la densità ideale di 5-10 colloidi d'oro sia presente nella regione di interesse prima di procedere. Per la configurazione ottica del fluoroforo della sonda anticorpi, apri il software di imaging e accedi alle impostazioni di configurazione ottica.

Seleziona lo specchio dicroico appropriato e imposta la lunghezza d'onda e la densità di potenza dell'eccitazione laser. Regola il tempo di integrazione della telecamera e seleziona il filtro di emissione. Poi, imposta il binning dei pixel della fotocamera per ottenere una dimensione di pixel compresa tra 150 e 160 nanometri.

Ora, crea una configurazione ottica per la fase di sbiancamento della foto selezionando una modalità di sbiancamento nella versione dell'immagine nell'immagine software. Imposta la potenza del laser al 100% e modifica il tempo di integrazione della fotocamera a un secondo. Imposta i parametri di imaging nel software di acquisizione dell'immagine definendo l'intervallo di non illuminazione, il numero di fotogrammi e la frequenza del passaggio di sbiancamento della foto.

Successivamente, preparare il tampone di imaging diluendo l'anticorpo CD81 a una concentrazione di 1 microgrammo per millilitro in 200 microlitri di 5%BSA prodotti in DPBS. La concentrazione finale raccomandata di anticorpi è 0,5 nanomolari per le cellule T Jurkat, o 2 nanomolari per le cellule U-2 OS. Aggiungere il buffer di imaging preparato al pozzo contenente le celle e avviare l'acquisizione dell'immagine nel software per iniziare la raccolta dei dati.

Utilizzare la funzione di visualizzazione in tempo reale nel software di imaging configurato per la marcatura a singolo anticorpo della membrana per monitorare il legame degli anticorpi in tempo reale. Configura i parametri di imaging nel software di acquisizione dell'immagine per ottenere almeno un'acquisizione di 10 fotogrammi e imposta l'intervallo non illuminato a cinque secondi. Avvia l'acquisizione e valuta la scarsità delle localizzazioni singole di molecole nel filmato registrato.

Se vengono osservati immediatamente dopo l'aggiunta del tampone di imaging si osservano più eventi di legame anticorpali sovrapposti, o se si accumulano localizzazioni singole nel tempo, si interrompe l'acquisizione. Riduci la concentrazione di anticorpi di due volte e ripeti l'acquisizione su un nuovo campione. Continuare a raddoppiare la concentrazione di anticorpi e rivalutare il numero di eventi per unità di area fino a raggiungere la densità desiderata di localizzazione di singola molecola.

Se la densità di eventi è scarsa, si duplica la concentrazione di anticorpi nel buffer di imaging. Ripetere l'acquisizione su un nuovo campione e continuare ad aumentare la concentrazione di anticorpi di raddoppio, rivalutando il numero di eventi di legame per unità di area fino a raggiungere la densità desiderata di localizzazione di singola molecola. Per l'ottimizzazione degli intervalli non illuminati, configurare i parametri di imaging nel software di acquisizione dell'immagine per ottenere un'acquisizione a 50 fotogrammi.

Dopo aver aggiunto l'anticorpo e avviato l'acquisizione, valuta la densità e la scarsità delle localizzazioni a singole molecole nel filmato registrato. Determinare l'intervallo non illuminato più basso che produce una densità ottimale di eventi di singola molecola. Infine, se si verificano eventi di legatura spazialmente sovrapposti durante l'acquisizione dell'immagine, introdurre un passaggio di sbiancamento fotografico a intervalli regolari.

Regolare la frequenza di fotosbiancamento in modo che la fluorescenza degli anticorpi legati venga rimossa prima che si accumulino eventi sovrapposti. Imposta il percorso del file nel software MATLAB sulla cartella che contiene il file di valori separati da virgole M nella cella ricostruito. Esegui il codice cliccando su Esegui nella barra MATLAB.

Quando richiesto, seleziona il file CSV della cella M e clicca su Open per caricarlo nel programma. Esegui l'analisi usando gli input precedentemente definiti come punto di partenza. Valutazione del diagramma a scatter contenente i dati di localizzazione non clusterizzati.

Scegli un valore minimo in punti che sia superiore al numero di localizzazioni del rumore ma inferiore al numero di localizzazioni sulla cella. Valuta la finestra che rappresenta i dati raggruppati. Confermare che i cluster siano mantenuti sulla cellula con il fenotipo atteso mentre le localizzazioni esterne alla cellula sono minimizzate.

Se i parametri di clustering sono troppo restrittivi, si diminuisce il valore minimo in punti e si aumenta l'epsilon. Se i parametri di clustering sono troppo inclusivi, aumentare il valore minimo in punti e diminuire l'epsilon. Infine, dopo aver regolato il valore minimo in punti ed epsilon, eseguire nuovamente il codice per ottenere un clustering ottimale.

I luccici T di Jurkat sono stati immobilizzati con sufficiente spazio per preservare l'integrità della membrana e permettere l'accesso degli anticorpi agli epitopi della membrana. I colloidi dorati sono stati visualizzati e utilizzati come marcatori fiduciali per la correzione della deriva laterale durante l'acquisizione dell'immagine delle cellule M. L'ottimizzazione dell'intervallo di non illuminazione ha mostrato che un intervallo di cinque secondi produceva eventi di legame degli anticorpi con minima sovrapposizione spaziale rispetto a intervalli più brevi o più lunghi a una concentrazione di nanomolari di anticorpi.

L'applicazione della correzione di deriva migliorò l'immagine ricostruita della cella M rispetto alla ricostruzione non corretta. Il clustering basato sulla densità delle localizzazioni delle celle M ha ridotto le interazioni di fondo a bassa densità e ha evidenziato gli eventi di legame clusterizzati di CD81. Possiamo osservare l'interazione degli anticorpi con i loro epitopi di membrana in un ambiente cellulare, fornendo informazioni rilevanti per gli anticorpi terapeutici.

La concentrazione di anticorpi, l'intervallo di non illuminazione e i passaggi di fotosbiancamento sono fondamentali da ottimizzare. Parametri subottimali compromettono i risultati. La marcatura a singolo anticorpo può essere estesa per valutare simultaneamente il legame delle proteine di membrana da parte di più anticorpi all'interno dello stesso ambiente cellulare.