Analisi della funzione Beta-cellulare usando la formazione immagine del calcio cella singola risoluzione in Zebrafish isolotti

Questo metodo può aiutare a comprendere domande importanti nel campo delle cellule beta. Come la funzione eterogeno IT tra le singole cellule beta all'interno di un'isola. Il vantaggio principale di questa tecnica è la risoluzione spaziale e temporale fornita dall'imaging dal vivo delle cellule beta.

Siamo in grado di catturare le oscillazioni del calcio all'interno delle singole cellule beta. Dopo aver soppresso un pesce secondo il protocollo di testo, trasferirlo in una capsula di Petrie contenente una soluzione HBSS con calcio e magnesio. Quindi, sotto uno stereomicroscopio dotato di una lampada a fluorescenza e di un cubo filtrante rosso, utilizzare una pinza affilata per tagliare la pelle dalla bocca alla pinna anale.

Staccare la pelle tagliata sul lato destro per esporre l'addome, che esporrà gli organi interni. Quindi, utilizzando la fluorescenza rossa per identificare l'espressione di mKO2 nelle cellule beta, individuare le isole. Pulire l'isola primaria rimuovendo con cura il tessuto circostante, come fegato e adipociti.

Prendere precauzioni per non ferire o colpire l'isolotto. Quindi pipettare una goccia da 30 microlitri di HBSS al centro di un piatto con fondo di vetro. Quindi trasferisci l'isolotto sezionato nella goccia.

Con HBSS, lavare accuratamente l'isolotto una volta, quindi utilizzare 30 microlitri di soluzione di lavoro di fibrinogeno per lavarlo una volta. Evitare di asciugare l'isolotto durante le fasi di lavaggio, che potrebbe provocare la morte cellulare. Aggiungere lentamente e delicatamente 10 microlitri da 10 unità per millilitro di soluzione di trombina all'isola.

Lasciare intatto l'isolotto e il piatto per 15-20 minuti. Osservare che la goccia di trombina del fibrinogeno diventerà viscosa e stabile. È necessario concedere un tempo sufficiente affinché la trombina polimerizzi nella soluzione di fibrinogeno.

In caso contrario, lo stampo non fornirà stabilità durante la sessione di imaging. Per eseguire l'imaging dal vivo ex vivo della fluorescenza GCaMP, aggiungere 200 microlitri di HBSS sulla parte superiore dello stampo e posizionare con cura il piatto sul supporto della piastra del microscopio confocale. Quindi, con un obiettivo di errore 20X 0,8 NA e l'opzione campo chiaro, individua l'isolotto.

Utilizzando il filtro per la fluorescenza rossa per visualizzare la fluorescenza nucleare mKO2 nelle cellule beta, concentrarsi sull'isola. I singoli nuclei dovrebbero essere chiaramente visibili. Individua un piano di imaging chiaro spostandoti manualmente attraverso lo spessore dell'isolotto lungo il suo asse Z.

Assicurarsi che il piano di imaging contenga da 50 a 100 cellule beta per l'imaging e che la luminosità della fluorescenza nucleare mKO2 sia uniforme, soprattutto al centro dell'isola. Successivamente, nel menu di configurazione intelligente, impostare un'acquisizione sequenziale per la fluorescenza GCaMP6 e mKO2 utilizzando le seguenti impostazioni. Per GCaMP6 scegliere un'eccitazione di 488 nanometri e un'emissione approssimativa da 500 a 555 nanometri.

In falso colore selezionare GFP. Per mKO2 scegliere un'eccitazione di 561 nanometri e un'emissione da 570 a 630 nanometri. Per il falso colore selezionare mCherry.

Nella modalità di acquisizione, impostare la risoluzione dell'immagine su 1.024 x 1.024 pixel, la velocità su 10 e la media su uno. Avviare una registrazione continua selezionando l'opzione per Serie temporali e impostando la durata su 500 cicli con un tempo di acquisizione di circa due secondi per fotogramma. Tieni d'occhio il ciclo di imaging.

Dopo i primi 50 fotogrammi senza perturbare l'acquisizione dell'immagine, pipettare delicatamente cinque microlitri di soluzione di D-glucosio 200 millimolare sopra il gel che trattiene l'isola. Quindi acquisire 150 fotogrammi a 10 millimolari di glucosio. I primi 50 fotogrammi della serie temporale corrispondono all'attività delle cellule beta a cinque millimoli di glucosio.

Questa è l'attività basale. Una cellula beta che risponde mostrerà un aumento e un calo della fluorescenza verde con il tempo. A 200 fotogrammi, aumentare la concentrazione di glucosio a 20 millimolari aggiungendo delicatamente 10 microlitri di D-glucosio da 200 millimolari.

Quindi acquisire 150 fotogrammi alla concentrazione di 20 millimolari. Per aprire il file immagine in FIJI, selezionare Plugin, LSM Toolbox, mostra LSM Toolbox. Nella casella degli strumenti LSM, fare clic su Apri LSM e selezionare il file immagine.

In Strumenti nel menu Analizza aprire ROI Manager. Con lo strumento di selezione dei poligoni situato nella barra degli strumenti, disegna manualmente il ROI. Disegna la ROI nel canale rosso in modo che copra un'area più grande di un nucleo per includere parte del citoplasma della cellula.

Assicurati che la posizione ROI sia coerente tra i fotogrammi e regola la posizione se necessario. Aggiungi le ROI selezionate al ROI Manager facendo clic sul pulsante Aggiungi. Seleziona e aggiungi più ROI per ottenere dati su più celle.

Quindi, dal menu Analizza, selezionare Imposta misure. Quindi selezionare Densità integrata per specificare l'estrazione dell'intensità di fluorescenza totale all'interno dell'area. Passa al canale verde contenente la fluorescenza GCaMP e in ROI Manager seleziona Multi Measure.

Questo fornirà le misure di intensità per le celle durante le serie temporali. Salva l'output FIJI come file di testo separato da virgole. Dalla casella degli strumenti LSM, ottenere i timestamp dei fotogrammi dell'immagine.

Utilizzare Applica timbri, Applica timbri t, Nome file, Dump su file di testo, per ottenere i timestamp. Salva i timestamp utilizzando l'opzione Salva con nome o copiali nel foglio di calcolo. Dopo aver compilato i valori di intensità per tutte le celle, eseguire l'analisi una cella alla volta o automaticamente.

Per ulteriori dettagli, fare riferimento al protocollo di testo. In questo esperimento, singole cellule beta primarie di isole da 45 linee transgeniche DPF che esprimono mKO2 e GCaMP6 nucleari specificamente in cellule beta, sono state stimolate con una rampa di glucosio e quindi depolarizzate con cloruro di potassio. È stata analizzata l'attività delle cellule.

Utilizzando FIJI e il software di analisi dei dati, è stata estratta e normalizzata l'intensità di fluorescenza GCaMP6 delle singole cellule beta. Come si vede da questa traccia di intensità di fluorescenza, le singole cellule beta mostrano oscillazioni nella fluorescenza GCaMP6 quando stimolate con glucosio e l'aggiunta di cloruro di potassio stabilizza la fluorescenza. La tecnica fornisce una risoluzione cellulare della reattività al glucosio delle cellule beta e una finestra sulla loro funzionalità.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 45 minuti se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura è importante verificare la vitalità delle cellule beta. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come le manipolazioni genetiche, per comprendere il ruolo di geni specifici sulla funzione delle cellule beta.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare la risposta del glucosio all'interno delle singole cellule beta.