Imaging ottico basato su fotodiodi per la registrazione di dinamiche di rete con risoluzione a singolo neurone in invertebrati non transgenici

Questo articolo rappresenta una descrizione dettagliata di come utilizzare un array di fotodiodi e coloranti sensibili al voltaggio per registrare i potenziali d'azione da un gran numero di neuroni contemporaneamente. Rispetto all'imaging del calcio dell'attività neurale, che è indiretta, i coloranti sensibili alla tensione che utilizziamo registrano potenziali d'azione direttamente simili alle registrazioni di elettrodi nitidi, ma su molti neuroni contemporaneamente. Il nostro flusso di lavoro di imaging ottico può essere adattato per visualizzare rapidamente l'attività della rete con risoluzione di un singolo neurone e di un singolo potenziale d'azione in una varietà di sistemi di invertebrati non transgenici e persino di vertebrati.

Inoltre, a dimostrare le procedure del nostro protocollo sarà Evan Hill del mio laboratorio. Inizia anestetizzando un animale Aplysia californica di 40 grammi e fissandolo con il lato ventrale rivolto verso l'alto in una capsula di dissezione foderata di cera. Usando le forbici da dissezione, praticare un'incisione della linea mediana di due o tre centimetri lungo l'estensione più anteriore del piede e fissare i lembi del piede su entrambi i lati dell'incisione per rivelare parte del sistema nervoso centrale e la massa buccale.

Usa pinze e forbici da dissezione per sezionare con cura la massa buccale, rivelando i gangli cerebrali, e recidere i nervi che innervano il corpo dell'animale per asportare il sistema nervoso centrale, lasciando una lunga lunghezza del nervo da stimolare. Utilizzare spilli minuziosi per posizionare il sistema nervoso centrale in un piatto rivestito di elastomero riempito di soluzione salina e perfondere il piatto con soluzione salina passata attraverso un dispositivo di raffreddamento Peltier per mantenere la temperatura di preparazione a 15-16 gradi Celsius. Utilizzare le pinze e le forbici da microdissezione per rimuovere il tessuto connettivo in eccesso dai nervi e sezionare una parte superficiale della guaina sul ganglio o sui gangli da visualizzare.

Quindi immergere il sistema nervoso centrale pulito in una soluzione di glutaraldeide allo 0,5% in soluzione salina per 20 secondi prima di riportare il sistema nervoso centrale nel piatto rivestito di elastomero perfuso con soluzione salina per sciacquare via la glutaraldeide in eccesso. Per preparare una soluzione di lavoro di colorante sensibile alla tensione, aggiungere 500 microlitri di soluzione salina a un'aliquota solida precedentemente preparata di RH 155 per ottenere una concentrazione finale di colorante di 0,3 milligrammi per millilitro. E usa un microdispenser portatile per caricare 200 microlitri di soluzione in un pezzo di tubo di polietilene con un diametro simile a quello del ganglio da colorare.

Utilizzando un micromanipolatore, posizionare con cura l'estremità del tubo sul ganglio bersaglio, abbassando il tubo fino a formare una tenuta aderente sul ganglione. Ruotare la manopola dell'applicatore del microdispenser ogni cinque minuti per un'ora per forzare più colorante sul ganglia, controllando il campione a 30 minuti per confermare che si stia verificando un'adeguata colorazione. Dopo la colorazione, mantenendo le luci soffuse, posizionare un materiale tampone appropriato a sinistra e a destra del punto in cui verrà collocata la preparazione nella camera di imaging contenente soluzione salina, quindi immergere il sistema nervoso centrale nella camera.

Premere un pezzo di vetrino coprioggetti di dimensioni adeguate sul tessuto e premere con decisione sul vetrino coprioggetti per appiattire il tessuto senza danneggiare i neuroni. Quindi posizionare la camera di imaging sotto un microscopio da dissezione. Se si stimola un nervo per suscitare un programma motorio fittizio, fondere con cura un segmento di tubo in polietilene PE100 su una fiamma tirando delicatamente entrambe le estremità del segmento del tubo e tagliare il cono risultante nel punto desiderato.

Quindi, collegare un pezzo di tubo flessibile in polimero a pareti spesse all'estremità posteriore di un elettrodo di aspirazione in polietilene. Quindi utilizzare una sezione della bocca per creare una pressione negativa e aspirare un piccolo volume di soluzione salina attraverso l'estremità conica dell'elettrodo di aspirazione. Disegnare l'estremità del nervo da stimolare nell'elettrodo al microscopio e confermare che la soluzione salina nell'elettrodo sia priva di bolle che potrebbero interrompere la conduzione elettrica.

Per l'imaging del ganglia, spostare la camera sul rig di imaging e avviare la perfusione salina attraverso la camera di registrazione. Posizionare una sonda di temperatura vicino alla preparazione e impostare la temperatura in base alla specie da riprendere. Posizionare un filo d'argento clorurato lungo l'elettrodo di aspirazione, assicurandosi che entri in contatto con la soluzione salina nell'elettrodo e posizionare un filo di cloruro d'argento e argento nella soluzione salina del bagno vicino all'elettrodo di aspirazione.

Abbassare la lente di immersione in acqua nella soluzione salina e chiudere il diaframma di base. Alzare o abbassare il condensatore del sottostadio e regolare la messa a fuoco fino a quando i bordi del diaframma non sono nitidamente a fuoco, creando l'illuminazione Kohler. Concentrati sulla regione del preparato da riprendere e acquisisci un'immagine del ganglio di interesse con la fotocamera digitale parafocale.

Impostare l'interruttore di guadagno del pannello di controllo su 1X e fare clic sul pulsante dell'intensità della luce a riposo per controllare l'intensità media della luce a riposo dei diodi. Regolare il livello di tensione inviato da uno stimolatore all'alimentazione della lampada a LED e continuare a controllare il livello medio di intensità della luce a riposo fino a quando non si trova nell'intervallo desiderato. Quindi impostare l'interruttore di guadagno del pannello di controllo su 100X per la registrazione e ricontrollare che la molla o il tavolo dell'aria siano flottanti.

Con le luci ancora soffuse, impostare la durata, il percorso e il nome del file nel software di imaging e fare clic su Acquisisci dati per acquisire i file fino alla capacità della RAM disponibile del computer. Fare attenzione a rimanere fermi durante la registrazione, poiché piccole vibrazioni possono introdurre grandi artefatti nei dati di registrazione ottica. Per visualizzare i dati immediatamente dopo l'acquisizione, utilizzare la funzione di sovrapposizione per sovrapporre i dati raccolti da tutti i 464 diodi sull'immagine gangliare e fare clic su uno qualsiasi dei diodi rappresentati nel software per espandere i dati registrati su una schermata di traccia separata.

Per ottenere un allineamento esatto dei diodi rispetto alla preparazione, inserire i fattori X, Y e di ingrandimento determinati da un test stenopeico. Per massimizzare la visibilità del potenziale d'azione e migliorare la resa dei neuroni per il successivo smistamento dei picchi, imporre un filtro Butterworth passa-banda con tagli a cinque e 100 Hertz per rimuovere sia il rumore a bassa che ad alta frequenza. Per salvare i dati ottici filtrati come file di testo per l'analisi successiva, nella schermata della pagina selezionare la casella Filtro TP.

E nella scheda di output, seleziona salva pagina come ASCII. Quindi inserisci un nome file appropriato nella finestra di dialogo che appare. Il contatto cutaneo con la sua stella mare, la sua predatrice innesca la fuga di Tritonia diomedia, che consiste in una serie ritmica di flessioni di tutto il corpo che la spingono via verso la salvezza.

In questa figura, sono mostrati i dati grezzi e filtrati di 20 diodi che registrano l'attività prima, durante e dopo la stimolazione del nervo del pedale tre. Immediatamente dopo l'acquisizione, i segnali misurati da tutti i 464 diodi dell'array di registrazione possono essere visualizzati topograficamente su un'immagine della preparazione nel software di imaging. In questa analisi, lo smistamento delle tracce di diodi filtrate con l'analisi dei componenti indipendenti, o ICA, ha prodotto 53 tracce neuronali uniche, 30 delle quali sono mostrate qui.

Uno stimolo fortemente avversivo della coda all'Aplysia californica suscita ondate ripetute di una risposta di fuga ritmica in due parti che consiste in un periodo di galoppo di diversi cicli di affondi della testa e tiri della coda che spostano rapidamente l'animale in avanti e un successivo periodo di strisciamento. In questa analisi rappresentativa, un minuto in una registrazione ottica continua di 20 minuti, il nervo nove del pedale è stato stimolato per suscitare la sequenza del programma del motore del galoppo-gattonamento. Le distribuzioni spaziali gaussiane probabilistiche dei segnali provenienti da tutti gli 81 neuroni registrati sono state mappate sul ganglione.

La riduzione della dimensionalità applicata alla registrazione completa ha rivelato che le fasi di galoppo e strisciamento del programma di fuga occupavano aree distinte e formavano traiettorie diverse nello spazio delle componenti principali. Quando si tenta questo protocollo, le considerazioni importanti includono: ottimizzare la colorazione, ridurre al minimo le vibrazioni e instradare una quantità sufficiente di luce attraverso la preparazione al PDA, riducendo al minimo il fotosbiancamento del colorante. Esempi di analisi post-acquisizione che hanno rivelato intuizioni di rete a livello di popolazione includono il rilevamento di insiemi funzionali tramite clustering del consenso nell'algoritmo di apprendimento non supervisionato e la riduzione della dimensionalità utilizzando l'analisi delle componenti principali.

La combinazione del nostro sistema di imaging basato su array di fotodiodi e dell'uso di coloranti assorbenti sensibili alla tensione consente il monitoraggio dell'evoluzione dinamica della rete per lunghi periodi di tempo.