Name: Dove si taglia materia: Una dissezione e analisi guida per lorientamento spaziale della Retina di topo da oculare luoghi dinteresse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Impara la dissezione della retina di topo utilizzando landmark oculari e immunocitochimica per orientare correttamente i poli dorsale, ventrale, nasale e temporale. Questo metodo standardizzato migliora l'accuratezza nelle ricerche neuroscientifiche.

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Vorremmo ringraziare giorno Brittany e Jessica Onyak per la loro assistenza tecnica e Dr. Liu per averci gentilmente fatto usare il suo microscopio epifluorescente. Riconoscimenti di supporto: NIH R15EY026255-01 e la Fondazione di Kirchgessner Karl.

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<li>Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+space+is+represented+by+nonmatching+topographies+of+distinct+mouse+retinal+ganglion+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types.</a> Current Biology. 24 (3), 310-315 (2014).</li>
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<li>Sabbah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retinal+code+for+motion+along+the+gravitational+and+body+axes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A retinal code for motion along the gravitational and body axes.</a> Nature. 546 (7659), 492-497 (2017).</li>
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<li>Huberman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62 (3), 327-334 (2009).</li>
<li>Ueki, Y., Ramirez, G., Salcedo, E., Stabio, M. E., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Ikbkap+causes+slow%2C+progressive+retinal+degeneration+in+a+mouse+model+of+familial+dysautonomia%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Loss of Ikbkap causes slow, progressive retinal degeneration in a mouse model of familial dysautonomia.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li>
<li>Maiorano, N. A., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+perinatal+retinal+degeneration+induces+retina+reshaping+and+correlated+structural+rearrangement+of+the+retinotopic+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Restricted perinatal retinal degeneration induces retina reshaping and correlated structural rearrangement of the retinotopic map.</a> Nat Commun. 4, 1938(2013).</li>
<li>Hadj-Said, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+topographical+analysis+of+the+losses+of+cone+photoreceptors+and+retinal+ganglion+cells+under+taurine+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative and topographical analysis of the losses of cone photoreceptors and retinal ganglion cells under taurine depletion.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4692-4703 (2016).</li>
<li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+temporal+topography+of+the+N-Methyl-+N-nitrosourea+induced+photoreceptor+degeneration+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The temporal topography of the N-Methyl- N-nitrosourea induced photoreceptor degeneration in mouse retina.</a> Sci Rep. 5, 18612(2015).</li>
<li>Risner, M. L., Pasini, S., Cooper, M. L., Lambert, W. S., Calkins, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axogenic+mechanism+enhances+retinal+ganglion+cell+excitability+during+early+progression+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Axogenic mechanism enhances retinal ganglion cell excitability during early progression in glaucoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2018).</li>
<li>Estevez, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form+and+function+of+the+M4+cell%2C+an+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cell+type+contributing+to+geniculocortical+vision%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Form and function of the M4 cell, an intrinsically photosensitive retinal ganglion cell type contributing to geniculocortical vision.</a> J Neurosci. 32 (39), 13608-13620 (2012).</li>
<li>Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transretinal+ERG+recordings+from+mouse+retina%3A+Rod+and+cone+photoresponses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transretinal ERG recordings from mouse retina: Rod and cone photoresponses.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Lin, B., Wang, S. W., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+type%2C+size%2C+and+spacing+can+be+specified+independent+of+homotypic+dendritic+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell type, size, and spacing can be specified independent of homotypic dendritic contacts.</a> Neuron. 43 (4), 475-485 (2004).</li>
<li>Ortin-Martinez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+distribution+of+mouse+retinal+cone+photoreceptors%3A+differences+between+an+albino+%28Swiss%29+and+a+pigmented+%28C57%2FBL6%29+strain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain.</a> PLoS One. 9 (7), 102392(2014).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+degeneration+and+apoptosis+patterns+of+cone+photoreceptors+in+rd11+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The degeneration and apoptosis patterns of cone photoreceptors in rd11 Mice.</a> J Ophthalmol. 2017, 9721362(2017).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+spatial+organization+of+Muller+glia+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anatomy and spatial organization of Muller glia in mouse retina.</a> J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).</li>
<li>Stabio, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+map+of+the+mouse+eye+for+orienting+retinal+topography+in+anatomical+space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space.</a> J Comp Neurol. 526 (11), (2018).</li>
<li>Lamb, T. D., Collin, S. P., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+vertebrate+eye%3A+Opsins%2C+photoreceptors%2C+retina+and+eye+cup%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evolution of the vertebrate eye: Opsins, photoreceptors, retina and eye cup.</a> Nat Rev Neurosci. 8 (12), 960-976 (2007).</li>
<li>Sterratt, D. C., Lyngholm, D., Willshaw, D. J., Thompson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+anatomical+and+visual+space+for+the+mouse+retina%3A+Computational+reconstruction+and+transformation+of+flattened+retinae+with+the+Retistruct+package%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Standard anatomical and visual space for the mouse retina: Computational reconstruction and transformation of flattened retinae with the Retistruct package.</a> PLoS Comput Biol. 9 (2), 1002921(2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

C' non è stato nessun protocollo completo, standardizzato per la determinazione e l'orientamento della retina di topo isolato nello spazio anatomico di etichettatura. Il protocollo dettagliato qui tenta di riempire questo vuoto standardizzando e dettagliare come utilizzare profondo anatomici come punti di riferimento in modo affidabile identificare orientamento retinica. È stato dimostrato che i profondo anatomici in questo protocollo forniscano un metodo più preciso e affidabile per orientare la retina di topo più superficiale punti di riferimento come bruciature corneali22. Così, gli studi che hanno contato sulle ustioni corneali per orientamento retinica possono avere avuto errori maggiori nell'orientamento rispetto a studi che hanno fatto affidamento su punti di riferimento quali i muscoli retti e fenditura coroidico. Questa discrepanza mette in evidenza la necessità e l'importanza di questo protocollo standardizzato per quanto riguarda l'interpretazione dei risultati e di effettuare confronti tra gli studi che dipendono da orientamento accurato della retina. Nel complesso, un protocollo standardizzato fornirà un metodo comune per i ricercatori di visione da seguire, eliminando così la presenza di una variabile di confusione nell'acquisizione di dati che può verificarsi con l'uso di metodi non standardizzati per l'identificazione della retina orientamento.
I metodi qui presentati sono facilmente ripetibile ed applicabile a molti tipi di protocolli sperimentali. Infatti, uno dei più grandi vantaggi di questo protocollo è la sua adattabilità. Perché la fenditura coroidico, espressione s-opsina e luoghi d'interesse del muscolo retto sono stati trovati per identificare in maniera affidabile orientamento retinica22 il punto di riferimento che meglio si adatta i parametri sperimentali possa essere scelti per ottimizzare l'acquisizione di dati (tabella 1). Inoltre, i metodi di dissezione possono essere combinati in modo da chiarire ulteriormente l'orientamento della retina. Ad esempio, fenditura coroidico tagli possono essere combinati con s-opsina immunohistochemistry per potersi orientare tutti i quattro poli della retina: emisferi nasali e temporali possono essere identificati dai tagli coroidico fenditura, e s-opsina immunohistochemistry può identificare emisferi ventrali e dorsali. Ancora, l'adattabilità del presente protocollo può essere vincolata dalla natura sensibili al tempo degli esperimenti di fisiologia. Poiché il tempo che necessario per identificare un punto di riferimento, fare un'ustione cornea ed eseguire un taglio alleviamento potrebbe provocare la morte di significativa del tessuto negli esperimenti ex vivo , alcuni di questi metodi di dissezione può essere meno ottimale. Fortunatamente, una volta un dissettore ha acquisire familiarità con la fenditura coroidico o il metodo di dissezione del muscolo retto superiore, individuando i punti di riferimento profondi e rendendo l'alleviamento tagli rapidamente diventano parte della routine di dissezione e non aggiungono significativamente alla lunghezza della dissezione. Anche se riconosciamo che i passaggi qui descritti possono aggiungere il tempo agli esperimenti estremamente sensibili al fattore tempo, suggeriamo di utilizzare il gradiente di s-opsina per post hoc, retinica orientamento quando la vitalità del tessuto non è più un problema (Figura 3 ). Macchiatura della retina per s-opsina è un modo efficace per orientare la retina, come può identificare tutti i quattro poli: s-opsina macchiatura divide la retina in poli dorsali e ventrali e permette l'identificazione del nasale e temporale poli a seconda che la retina è da un occhio destro o sinistro (Figura 3). Pertanto, riteniamo che questo protocollo offre un insieme affidabile e ripetibile di metodi per orientamento accurato della retina che può soddisfare qualsiasi parametri sperimentali.
Come con qualsiasi modifica per la dissezione della retina, la validità del metodo di dissezione è limitata dalla precisione del dissettore e la qualità del tessuto che è stato isolato. Se tutto il tessuto viene perso durante la dissezione o una retina è troppo danneggiata per la ricostruzione accurata, Retistruct e il programma MATLAB non sarà in grado di ricostruire in modo affidabile o di orientare la retina. Pertanto è importante praticare il metodo di dissezione prima di utilizzarlo per la raccolta di dati di esperimenti. Mentre i tipi delle dissezioni spiegato qui non sono difficili, deve essere praticati per assicurare la ripetibilità di identificare l'orientamento della retina con un particolare punto di riferimento. Inoltre, è indispensabile che la pratica di dissettore identificare visivamente i reperi anatomici prima di iniziare la raccolta dei dati per assicurarsi che il punto di riferimento corretto viene utilizzata. È un modo per verificare la precisione di un dissettore particolare per rendere entrambi fenditura coroidico tagli o muscolo retto superiore tagli e quindi confrontare la posizione dei tagli per il gradiente di s-opsina, poiché è un segno fisso e quindi non dipenda la precisione di dissectio n. potenziali dissettori possono anche confrontare le loro retine ricostruite agli esempi di retine ricostruite con punto di riferimento accurato tagli sono mostrati nella Figura 1 e nella figura 2. Essenzialmente, un dissettore potenziale deve eseguire la procedura descritta in questo protocollo per un tipo particolare di dissezione, sia esso il muscolo retto superiore o coroide fessurarsi metodo e confrontare i risultati con il gradiente di s-opsina per stabilire la validità di un dissettore di particolare. Perché se non è sicuro circa la posizione del punto di riferimento il dissettore, può provocare un orientamento impreciso della retina che sarà, per impostazione predefinita, colpiscono interpretazione e raccolta dei dati.

Un aspetto importante e a volte trascurato delle neuroscienze retinica è l'orientamento corretto e l'analisi della retina isolata intero-monta, sia esso l'orientamento di una retina in una camera di registrazione di elettrofisiologia o su un vetrino istologico. Ciò è particolarmente importante per gli studi che coinvolgono la retina di topo, che è attualmente il modello più utilizzato per le indagini del sistema visivo dei mammiferi. Recenti scoperte rivelano che la retina di topo non è spazialmente uniforme ma ha gradienti di densità e dimensione di tipi di cellule retiniche funzionalmente distinte, come cellule del ganglio melanopsina, le cellule del ganglio di OFF-alfa transitorie e opsine cono1,2 ,3,4,5. Di conseguenza, il metodo utilizzato per determinare l'orientamento della retina può influenzare i risultati sperimentali che coinvolgono cellule tipo o opsina distribuzioni2,3,6, direzione tuning di direzione-selettivo ganglio cellule7,8,9e modelli topografici di degenerazione retinica10,11,12,13,14 . In realtà, non segnalazione orientamento come retinica è segnalato può causare discrepanze nella letteratura e nella confusione quando si tenta di confrontare i dati tra gli studi. Pertanto è fondamentale che i ricercatori riferiscono il metodo per identificare l'orientamento della retina in modo che i risultati di tali studi possono essere interpretati in modo accurato.
Orientamento della retina viene comunemente identificato segnando la cornea dorsale, ventrale, nasale o temporale prima enucleazione oculare1,3,12,15,16,17 ,18,19 o da taglio o macchiatura avventurare profondo anatomico occhio muscoli extraocular6,7, coroide fissure20,21, o s-opsina sfumatura2,3. I muscoli retti utilizzabile per identificare le dorsali, ventrali, nasale e retina temporale facendo un taglio profondo sollievo che taglia in due il pignoramento di uno il retto superiore, retto inferiore, rectus mediale o muscolo di rectus laterale, rispettivamente. Tuttavia, per la maggior parte degli esperimenti, usando un muscolo retto è sufficiente per orientare la retina22. Fessura del coroidico, che è un residuo di sviluppo dell'occhio, può essere visto come una sottile linea orizzontale sulla parte posteriore dell'occhio. Ogni fine di questa riga termina alle vie nasali o il Polo temporale del globo23. Infine, espressione di s-opsina assimetricamente è distribuito alla retina ventrale nei topi, e s-opsina anticorpi possono essere usati per rivelare la retina ventrale in immunohistochemical esperimenti1.
Recenti lavori di Stabio, et al. 22 hanno dimostrato che superficiale oculare luoghi d'interesse quali le ustioni corneali sono un metodo meno affidabile per orientare la retina nello spazio anatomico, probabilmente a causa di errori umani e variabilità nel rendere l'ustione cornea quando si utilizza il temporale e mediale canthi come punti di riferimento. Al contrario, profonde luoghi d'interesse, quali il muscolo retto superiore, fenditura coroidico e il gradiente di s-opsina, hanno dimostrati di essere più affidabili e precisi punti di riferimento per orientare la retina22. Tuttavia, l'identificazione di questi punti di riferimento anatomici richiede passaggi di dissezione unici che non sono descritti in dettaglio nella letteratura. Così, l'obiettivo del presente protocollo è di fornire un tutorial completo su come usare il muscolo retto superiore, fenditura coroidico e gradiente s-opsina per identificare con precisione l'orientamento spaziale della retina di topo. Inoltre, abbiamo incluso un confronto tra l'efficacia di due anticorpi s-opsina, nonché un protocollo per s-opsina immunohistochemistry.
Un'ulteriore sfida per studi basati su preciso orientamento retinica è i grandi tagli alleviamento richiesti per appiattire le retine wholemount su una camera di registrazione, un piatto o una diapositiva. Questo può comportare alcune difficoltà per l'analisi di ciò che è naturalmente una struttura tridimensionale, quando esso è immaginata come una struttura piana bidimensionale. Un programma chiamato Retistruct24 può essere utilizzato per restituire un piatto wholemount della retina alla sua struttura tridimensionale prima che i dati raccolti da esso viene analizzati. Così, una sezione di questo protocollo è dedicata a evidenziare i passaggi che sono necessari per l'utilizzo del software Retistruct per ricostruire le retine s-opsina immunostained del mouse. Abbiamo inserito anche una sezione del protocollo per l'utilizzo dei nostri script MATLAB personalizzato, che è stato sviluppato per retine accuratamente ruotare e Oriente del mouse colorate con s-opsina.

Soluzione <table><tbody><tr><td>salina tamponata con fosfato 0,1 M</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P5244</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan2 Microscopio epifluorescente</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Smalto trasparente</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Corning LSE Agitatore orbitale a bassa velocità</td><td>Sigma-Aldrich CLS6780FP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Costar Piastre a 24 pozzetti trattate</td><td>con TC Sigma-Aldrich</td><td></td> Microscopio di dissezione CLS3524 <td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Asino anti-capra Alexa 594</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>Asino anti-coniglio Alexa 594</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>Asino Siero Normale</td><td>Millipore</td><td>566460</td><td>Utilizzare al 5,2% (52 &mu; L con 86 &mu; L del 20% Triton X-100 e 863 &mu; L di 0,1 M PBS per 1 mL di soluzione bloccante)</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Vetrini per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-s-opsin</td><td>Santa Cruz Biotechnologies&nbsp;</td><td>sc-14363</td><td>Non disponibile commercialmente a partire dal 2017</td></tr><tr><td>Graefe Curved Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ o FIJI</td><td>National Institute of Health</td><td>N/A Software</td><td>disponibile gratuitamente</td></tr><tr><td>Cauterizzazione a bassa temperatura Cauterizzatore oftalmico a punta fine</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA00</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>Almeno versione 2007b o successivo</td></tr><tr><td>Occhiali Micro Cover&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Micro Vassoi per vetrini</td><td>VWR International</td><td>82020-913</td><td></td></tr><tr><td>Moira Ultra Fine Pinza</td> Strumenti <td>per la scienza fine&nbsp;</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Membrana di nitrocellulosa</td><td>Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>15714-S Uso</td><td>al 4% (25 &mu; L e 875 &mu; L di 0,1 M PBS per 1 mL di fissativo)</td></tr><tr><td>Ago PrecisionGlide 20G (0,90 mm x 25 mm)&nbsp;</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Glass Petri Dish</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3160152</td><td></td></tr><tr><td>R</td><td>The R Project for Statistical Computing</td><td>N/A</td><td>Software disponibile gratuitamente; versione 3.4.3 o successiva</td></tr><tr><td>Rabbit anti-s-opsin</td><td>Millipore</td><td>ABN1660</td><td></td></tr><tr><td>Retiga R3 Microscopio Fotocamera</td><td>Qimaging</td><td>01-RET-R3-R-CLR-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Retistruct</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Software disponibile gratuitamente&nbsp; compatibile con Windows 7 o Windows 10</td></tr><tr><td>Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Mounting Media</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-390-5</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Utilizzo 1,7% (86 &mu; L di 20% Triton-X con 52 &mu; L di siero normale d'asino e 863 &mu; L di 0,1 M PBS per 1 mL di soluzione bloccante)</td></tr><tr><td>Forbici per dissezione a molla Vannas&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio USB da 5 MP Fotocamera digitale</td><td>AmScope</td><td>MU500</td><td>Da utilizzare con il microscopio da dissezione Olympus</td></tr></tbody></table>

dove si taglia materia: una dissezione e analisi guida per l'orientamento spaziale della retina di topo da oculare luoghi d'interesse

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Accurato e affidabile orientamento spaziale della retina di topo isolato l'identificazione è importante per molti studi visual Neuroscience, tra cui l'analisi della densità e dimensione gradienti di tipi di cellule della retina, la sintonizzazione di direzione della direzione-selettivo le cellule del ganglio e l'esame dei modelli topografici degenerazione in alcune malattie della retina. Tuttavia, ci sono molti metodi di dissezione oculari diversi segnalati nella letteratura che vengono utilizzati per identificare ed etichettare retinica orientamento nella retina di topo. Mentre il metodo di orientamento utilizzato in tali studi è spesso trascurato, non segnalazione orientamento come retinica è determinato può causare discrepanze nella letteratura e nella confusione quando si tenta di confrontare i dati tra gli studi. Superficiale oculare luoghi d'interesse quali le ustioni corneali sono comunemente usati, ma recentemente sono stati indicati per essere meno affidabile rispetto a punti di riferimento più profondi come i muscoli retti, la fessura Coroidea o il gradiente di s-opsina. Qui, forniamo una guida completa per l'utilizzo di luoghi d'interesse profondo oculare accuratamente sezionare e documentare l'orientamento spaziale di una retina di topo isolato. Abbiamo anche confrontato l'efficacia di due anticorpi s-opsina e incluso un protocollo per s-opsina immunohistochemistry. Perché orientamento della retina secondo il gradiente di s-opsina richiede ricostruzione retinica con software Retistruct e rotazione con codice personalizzato, abbiamo presentato i passaggi importanti necessari per utilizzare questi due programmi. Nel complesso, l'obiettivo del presente protocollo è per fornire un insieme affidabile e ripetibile di metodi per l'orientamento esatto della retina che è adattabile ai protocolli più sperimentali. Un obiettivo globale di questo lavoro è quello di standardizzare i metodi di orientamento della retina per gli studi futuri.

Un unico taglio alleviamento che taglia in due il muscolo retto superiore esattamente ed attendibilmente identifica la retina dorsale (Figura 1). La fessura Coroidea esattamente ed attendibilmente identifica la retina nasale e temporale con alleviamento profondi tagli lungo la fessura Coroidea temporale e nasale (Figura 2). In questo esempio, un taglio alleviamento è stato fatto anche nella retina dorsale al fine di identificare l'asse dorsale/ventrale della retina (Figura 2D, freccia verticale). I passaggi di questi processi sono indicati per scopo di replica da dissettori futuri. Una combinazione di s-opsina immunohistochemistry (Figura 3A e 3D), ricostruzione con software Retistruct (3B, 3E) e la rotazione con un codice personalizzato di MATLAB (3C, 3F) permette la identificazione delle metà ventrale e dorsale della retina, come pure i poli nasali e temporali, se è noto se la retina è da un occhio destro o sinistro (Figura 3). Abbiamo anche confrontato due anticorpi primari s-opsina comunemente usati per l'efficacia della etichettatura coni s-opsina (Figura 4A-D): entrambi la capra anticorpo primario anti-s-opsina e l'anticorpo primario di coniglio anti-s-opsina efficacemente etichetta coni di s-opsina (Figura 4E) nello stesso mouse.
Alleviamento tagli sono stati identificati su retine immunostained ricostruito s-opsina e loro posizioni sono state confrontate con l'orientamento determinato dal gradiente s-opsina. Utilizzando il nostro personalizzato MATLAB codice (Vedi Materiali supplementari), retine sono state accuratamente ruotata in modo che la più alta concentrazione di s-opsina macchiatura è situata ventralmente, ponendo così vero dorsale a 90 ° (per il retto superiore), vero nasale a 0 ° (per nasale coroidico fenditura) e vero temporale (per fenditura coroidico temporale) a 180 °. Il valore di ogni individuo alleviamento angolo di taglio è stato determinato tramite lo strumento angolo ImageJ dopo le retine sono state ruotate secondo il gradiente di s-opsina. Un angolo medio è stato calcolato per ogni alleviamento tagliato tipo e il valore medio di ogni tipo di taglio allevia quindi era tracciato su un diagramma polare (Figura 6). In media, tagli di muscolo retto superiore identificato il Polo dorsale a 96,3 ± 4,3 ° (n = 11) (Figura 6). La fessura Coroidea nasale il Polo nasale a 6,7 ± 5,8 ° e identificate la fessura Coroidea temporale il Polo temporale a 172.0 ± 4,4 ° (n = 9; Figura 6).
<img alt="Analisi al microscopio della struttura oculare; effetto ustione dorsale; diagrammi di neuroanatomia; dati di ricerca." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: utilizzando il muscolo retto superiore per identificare con precisione la dorsale retina di un occhio di destra. (A) un esempio di un'ustione cornea dorsale nei pressi del confine corneale scleral fatto con una penna di punta di cauterio (freccia bianca). Il muscolo retto superiore è anche visibile in questa visualizzazione (freccia bianca). (B) un esempio di un intera retina montato con un alleviamento taglio nella retina dorsale di bisecando il muscolo retto superiore. Freccia rappresenta il profondo alleviando il taglio effettuato nella retina dorsale di bisecando il muscolo retto superiore. La retina è macchiata con anticorpo primario capra anti-s-opsina (Vedi Tabella materiali) e di anticorpo secondario asino anti-capra Alexa 594 (Vedi Tabella materiali; eccitazione: 590 nm; emissione: 620 nm) (ciano). Retina era imaged con un microscopio epifluorescente con un filtro di Texas Red (595 nm). (C) A retina ricostruito in Retistruct e ruotato con un codice personalizzato di MATLAB (Vedi Materiali supplementari) con il rectus superiore muscolo relieving taglio visibile (freccia bianca). D: dorsale, v: ventrale, t: temporale, n: nasale. Scala bar = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig1large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Analisi dello sviluppo dell'occhio; ustione dorsale e fessura coroide; immagine al microscopio; diagramma anatomico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: usando la fessura Coroidea per identificare con precisione i poli nasali e temporali della retina dell'occhio di destra. (A) un esempio di un'ustione cornea dorsale nei pressi del confine corneale scleral fatto con una penna di punta di cauterio. (B), della coroide fessura visibile sulla parte posteriore dell'occhio sulla sclera (freccia bianca). L'ustione cornea dorsale è anche visibile in questa visualizzazione, situata a circa 90° dalla fessura temporale coroidico. (C), della coroide fessura visibile sulla parte posteriore dell'occhio sulla sclera, in viaggio dal nervo ottico al confine corneale scleral. (D) una retina macchiato con capra anti-s-opsina (Vedi Tabella materiali) e di anticorpo secondario asino anti-capra Alexa 594 (Vedi Tabella materiali; eccitazione: 590 nm; emissione: 620 nm) (ciano) con tagli di fenditura coroidico (orizzontale le frecce) e la dorsale alleviamento tagliato (freccia verticale). Retina era imaged con un microscopio epifluorescente con un filtro di Texas Red (595 nm). (E) una retina ricostruito in Retistruct e ruotato con un codice personalizzato di MATLAB (Vedi materiali supplementari) con il taglio di alleviamento dorsale e i tagli di nasale e temporale coroidico fenditura visibili (frecce bianche). D: dorsale, v: ventrale, t: temporale, n: nasale. Scala bar = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig2large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Diagramma di mappatura della retina; analisi della retina destra e sinistra; visualizzazione non ruotata e ruotata." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: utilizzando la sfumatura di s-opsina per identificare tutti i quattro poli della retina. (A), un esempio di una retina sezionato da un occhio di destra che è stato immunostained per etichettare s-opsina e imaged con un microscopio epifluorescente con un filtro di Texas Red (595 nm). I tagli in questa retina sono arbitrari poiché l'orientamento topografico è determinato dal gradiente s-opsina. (B) i risultati di ricostruire la retina in A con Retistruct. Si noti che la sfumatura di s-opsina non è allineata correttamente, perché la retina non è stata eseguita mediante il codice MATLAB personalizzato (Vedi Materiali supplementari). (C) i risultati di rotazione la retina nella A con codice personalizzato. La retina è stata ruotata in modo che la più alta concentrazione di s-opsina macchiatura si trova nella parte inferiore e identificata come retinico ventrale. Poiché la retina è da un occhio di destra, il lobo temporale è situato 90° in senso antiorario dal Polo dorsale e il Polo nasale si trova 90° in senso orario dal Polo dorsale. (D) un esempio di una retina sezionato da un occhio di sinistra che è stato immunostained per etichettare s-opsina e imaged con un filtro di Texas Red (595 nm). I tagli in questa retina sono arbitrari poiché l'orientamento topografico è determinato dal gradiente s-opsina. (E) i risultati di ricostruire digitalmente la retina in D con Retistruct. Si noti che la sfumatura di s-opsina non è allineata correttamente, perché la retina non è stata ruotata di codice personalizzato. (F) i risultati di rotazione la retina in D con il codice personalizzato. La retina è stata ruotata in modo che la più alta concentrazione di s-opsina macchiatura si trova nella parte inferiore e identificata come retinico ventrale. Poiché la retina è da un occhio di sinistra, il Polo nasale si trova 90° in senso antiorario dal Polo dorsale e il lobo temporale è situato 90° in senso orario dal Polo dorsale. D: dorsale, v: ventrale, t: temporale, n: nasale. Scala bar = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig3large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="immagini al microscopio per immunocolorazione anti-S-Opsin, coniglio di capra; sezioni trasversali istologiche; Grafico dei dati" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: confronto di due anticorpi primari s-opsina in etichettatura coni s-opsina. (A) A retina macchiato con l'anticorpo di capra anti-s-opsina primario (Vedi Tabella materiali). (B) altre retina dello stesso mouse macchiato con l'anticorpo primario di coniglio anti-s-opsina (Vedi Tabella materiali). (C), A rappresentante regione (0,1 x 0,1 mm2) da una retina macchiato con l'anticorpo di capra anti-s-opsina primario. Immagine catturata su un microscopio epifluorescente a 40 ingrandimenti. (D), una rappresentante regione (0,1 x 0,1 mm2) da una retina macchiata di coniglio anti-s-opsina (Vedi Tabella materiali), un'alternativa di anticorpo primario. Immagine è stata scattata su un microscopio epifluorescente a 40 ingrandimenti. (E) entrambi gli anticorpi etichetta lo stesso numero di segmenti esterni s-cono perché non c'è nessuna differenza significativa nel numero di immunopositive s-coni che sono macchiati di capra anti-s-opsina e coniglio anti-s-opsina presso uno qualsiasi dei retinico testata eccentricità (n = 2; ANOVA con post hoc test di Bonferroni; p &gt; 0.05). Scala bar = 1 mm (A-B); 25 µm (C-D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Analisi dell'equilibrio statico, diagramma dell'interfaccia software con dati di imaging, che mostra struttura e risultati." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: una guida visiva per l'utilizzo del software Retistruct per ricostruire le retine immunostained con s-opsina. (A) A retina aperti in Retistruct con il contorno visibile e una "Tear" aggiunto. Punti dello "Strappo" sono indicati con frecce bianche sovrapposte. Tutti i tagli in questa retina sono arbitrari, come nessun particolare punto di riferimento è stato utilizzato per contrassegnare retinica orientamento durante la dissezione. Tasti importanti sono delineati in rosso. (B) una retina con tutte le "Tears" aggiunto e la retina dorsale identificato con "D" sul bordo della retina. Si noti che il pulsante di "Ricostruire la Retina" è ora visibile. Tasti importanti sono delineati in rosso. (C) il processo di ricostruzione una retina. Il diagramma polare della retina ricostruita appariranno sulla destra, mostrando che l'alleviamento tagli in ciano (frecce blu sovrapposte per chiarire le posizioni di taglio). (D) il risultato finale dell'esecuzione una retina attraverso Retistruct. La retina wholemount originale rimane sulla sinistra e la retina ricostruita appare sulla destra. I tagli di scarico sono visibili in ciano (frecce bianche sovrapposte per chiarire le posizioni di taglio). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Grafico radiale che mostra le direzioni dei muscoli oculari; retto superiore, dati delle ragadi coroidie (nasali, temporali)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figura 6: la fessura di coroide e del muscolo di rectus superiore può essere utilizzata per orientare con precisione la retina di topo. Un diagramma polare degli angoli ottenuti da entrambi muscolo retto superiore alleviamento tagli o fenditura coroidico tagli in retine sono state ricostruite con Retistruct. Alleviamento tagli sono stati identificati su retine immunostained ricostruito s-opsina e loro posizioni sono state confrontate con la posizione della sfumatura s-opsina. Utilizzando il codice personalizzato di MATLAB per ruotare con precisione le retine in modo che la più alta concentrazione di s-opsina macchiatura è situato ventralmente, vero dorsale (90° per retto superiore), true nasale (0° per la fenditura coroidico nasale) e vero temporale (a 180° per temporale coroide fenditura) sono stati determinati per ogni retina. Il valore di ogni angolo di taglio è stata determinata in ImageJ e un angolo medio di alleviamento individuali è stato calcolato per ogni alleviamento tagliato tipo. Tagli di muscolo retto superiore identificato il Polo dorsale a 96,3 ± 4,3 ° (n = 11). La fessura Coroidea nasale il Polo nasale a 6,7 ± 5,8 ° e identificate la fessura Coroidea temporale il Polo temporale a 172.0 ± 4,5 ° (n = 9). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Pietra miliare profondo</td>
			<td>Posizione di ustione corneale</td>
			<td>Polo della Retina identificato</td>
			<td>Applicazione a titolo sperimentale</td>
		</tr>
<tr>
<td>Retto superiore</td>
			<td>Dorsale</td>
			<td>Dorsale</td>
			<td>Dal vivo o fisso</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fenditura coroidico nasale</td>
			<td>Dorsale</td>
			<td>Nasale</td>
			<td>Dal vivo o fisso</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fenditura coroidico temporale</td>
			<td>Dorsale</td>
			<td>Temporale</td>
			<td>Dal vivo o fisso</td>
		</tr>
<tr>
<td>S-opsina gradiente</td>
			<td>Nessuno</td>
			<td>Dorsali, ventrali, nasale e temporale</td>
			<td>Fisso</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Profonde punti di riferimento, il Polo della retina si identificano, e se possono essere utilizzati per applicazione diretta o fisse del tessuto.

Questo protocollo fornisce una guida completa di dissezione e analisi per l'utilizzo di luoghi d'interesse profondo oculare, s-opsina immunohistochemistry, Retistruct e codice personalizzato esattamente ed attendibilmente orientare la retina di topo isolato nello spazio anatomico.

Dove si taglia materia: Una dissezione e analisi guida per l'orientamento spaziale della Retina di topo da oculare luoghi d'interesse

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

Lo scopo di questo protocollo di dissezione è quello di fornire una metodologia standardizzata per l'uso di punti di riferimento anatomici oculari, come i muscoli retti, la fessura coroide e il gradiente S-opsina per l'orientamento topografico della retina del topo. Il vantaggio principale di queste tecniche è che forniscono un modo affidabile per identificare con precisione i poli dorsale, ventrale, nasale e temporale di una retina di topo isolata. Inizia identificando un punto sulla cornea dorsale vicino al bordo della cornea sclera e tra il canto nasale e temporale.Toccare la cornea con una penna cauterica riscaldata per meno di un secondo per creare un segno di bruciatura a scopo di orientamento. Ripetere per il secondo occhio. La presenza dell'ustione dorsale consente l'identificazione del muscolo retto superiore.Per l'enucleazione, utilizzare una pinza curva per spingere delicatamente l'occhio fuori dalla sua orbita e afferrare il globo da sotto. Quindi, sollevare lentamente il globo dalla sua presa e contemporaneamente spostarlo delicatamente da sinistra a destra fino a quando il globo non viene rilasciato dalla presa. Trasferire il globo con i muscoli retti attaccati in una capsula di Petri contenente terreno di dissezione.Se lavori con entrambi gli occhi, assicurati di tenere traccia di quale occhio è l'occhio sinistro e quale è l'occhio destro. Sotto l'endoscopio di dissezione, localizzare visivamente l'ustione corneale dorsale e identificare il muscolo retto superiore a cui è associata. Usando le forbici da dissezione o un ago calibro 20, perforare la cornea in corrispondenza del segno di bruciatura.Quindi, eseguire un profondo taglio di sollievo nel globo verso il nervo ottico per dividere in due il muscolo superiore. Qui si vede una retina isolata con questo taglio, mentre qui viene mostrata la retina ricostruita con questo taglio. Usa due serie di pinze per iniziare a isolare la retina strappando delicatamente il foro praticato con la puntura fino a quando parte della retina non è esposta.Quindi, separare la retina dalla sclera fino a quando la sclera non è stata completamente rimossa. Rimuovere l'iride, il cristallino, il vitreo e tutte le strutture rimanenti fino a quando la retina non è completamente isolata. La presenza di un'ustione dorsale consente l'identificazione della fessura coroide nasale e temporale.Se si lavora con l'occhio destro, la fessura coroide nasale si trova a destra dell'ustione e la fessura coroide temporale si trova a sinistra dell'ustione. Questo è l'opposto del lavoro con l'occhio sinistro. Per utilizzare il punto di riferimento della ragade coroidea per identificare l'orientamento della retina, individuare e identificare la fessura coroidea sul retro dell'occhio.Orientare il globo in modo che il segno di bruciatura dorsale si trovi al polo superiore, come sarebbe se l'occhio fosse ancora nel topo. Quindi, usa le forbici da dissezione o un ago calibro 20 per fare una puntura nel globo, prima dove si trova l'ustione dorsale. Quindi, eseguire un taglio di sollievo poco profondo verso il nervo ottico dove si trova l'ustione corneale dorsale.Quindi, eseguire i seguenti due profondi tagli di sollievo verso il nervo ottico. Uno allineando le lame delle forbici da dissezione con la linea della fessura coroide temporale sul retro dell'occhio, e uno allineando le lame delle forbici da dissezione con la linea della fessura coroide nasale sul retro dell'occhio. Questi tagli sono mostrati qui su una retina isolata e ricostruita.Dopo aver effettuato questi tagli, utilizzare due serie di pinze per strappare delicatamente i fori di puntura fino a quando parte della retina non è esposta. Usando le forbici da dissezione, fai quattro tagli di sollievo nella retina in modo che rimanga piatta. Montare la retina, con le cellule gangliari rivolte verso l'alto, sulla membrana di nitrocellulosa premendo delicatamente ogni angolo della retina sulla membrana con una pinza.Quindi, utilizzare una pinza per immergere la retina montata in un millilitro di paraformaldeide al 4% contenuta nel primo pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Posizionare la piastra a 24 pozzetti su un agitatore orbitale a temperatura ambiente e fissare la retina per esattamente 40 minuti. Dopo il fissaggio, trasferire la retina nel secondo pozzetto della piastra, che viene riempito con un millilitro di PBS molare 0,1 e lavare la retina per 15 minuti a temperatura ambiente.Al termine del lavaggio, trasferire la retina montata nel quinto pozzetto contenente un millilitro di soluzione bloccante e incubare per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, aggiungere l'anticorpo primario anti-S-opsina di coniglio alla soluzione bloccante a una concentrazione da uno a 500 e incubare per tre giorni a quattro gradi Celsius. Dopo i tre giorni di incubazione, lavare l'anticorpo primario in eccesso dalla retina sei volte posizionandolo in sequenza in sei pozzetti riempiti con un millilitro di PBS per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente.Quindi posizionare la retina lavata in un pozzetto con una soluzione bloccante fresca e aggiungere l'anticorpo secondario Alexa 594 anti-coniglio d'asino. Incubare la retina con l'anticorpo secondario durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, lavare la retina in PBS sei volte, come in precedenza.Usando una pinza, trasferire la retina montata in una capsula di Petri contenente PBS. Rilasciare la retina dalla membrana di nitrocellulosa inserendo delicatamente le punte delle pinze tra la retina e la membrana fino a quando la retina non è più attaccata. Immergere un vetrino da microscopio in vetro nel PBS e montare la retina sul vetrino facendola galleggiare sul vetrino e punzecchiandola delicatamente con una pinza fino a quando la retina non si attacca al vetro.Coprire la retina sul vetrino con un mezzo di montaggio e posizionare un vetrino coprioggetti da 1,5. Metti il vetrino in un vassoio per vetrini e lascialo riposare a temperatura ambiente per un'ora. Dopo un'ora, posizionare il vassoio per vetrini a quattro gradi Celsius.Dopo che il vetrino è stato scivolato per 24 ore, utilizzare lo smalto per unghie per sigillare i lati del vetrino per evitare l'essiccazione. Questo è un esempio di retina isolata dall'occhio destro che è stata immunocolorata per marcare la S-opsina e visualizzata con un microscopio a epifluorescenza. È importante notare che i tagli in questa retina sono arbitrari poiché l'orientamento topografico può essere identificato dal gradiente S-opsina.L'immagine acquisita della retina può quindi essere ricostruita digitalmente con il software ReadiStruct. I tagli originali sono pseudo-colorati di rosso in questa immagine. Si noti che il file di output di questo programma non allinea correttamente la retina.Dopo che la retina è stata analizzata attraverso il codice di laboratorio mat personalizzato, la retina viene ruotata in modo che la massima concentrazione di colorazione S-opsina venga posizionata nella parte inferiore e identificata come retina ventrale. Questa immagine mostra la retina di un occhio sinistro. Il polo temporale si trova a 90 gradi in senso antiorario dal polo ventrale e il polo nasale si trova a 90 gradi in senso orario dal polo ventrale.Una volta padroneggiate, queste tecniche di dissezione possono essere eseguite piuttosto rapidamente in pochi minuti se eseguite correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come orientare in modo accurato e affidabile la retina del topo utilizzando il muscolo retto superiore, la fessura coroide o il gradiente S-opsina come punto di riferimento.

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Dove si taglia materia: Una dissezione e analisi guida per lorientamento spaziale della Retina di topo da oculare luoghi dinteresse (Video) | JoVE Journal

Dove si taglia materia: Una dissezione e analisi guida per l'orientamento spaziale della Retina di topo da oculare luoghi d'interesse

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