Dove si taglia materia: Una dissezione e analisi guida per l'orientamento spaziale della Retina di topo da oculare luoghi d'interesse

Lo scopo di questo protocollo di dissezione è quello di fornire una metodologia standardizzata per l'uso di punti di riferimento anatomici oculari, come i muscoli retti, la fessura coroide e il gradiente S-opsina per l'orientamento topografico della retina del topo. Il vantaggio principale di queste tecniche è che forniscono un modo affidabile per identificare con precisione i poli dorsale, ventrale, nasale e temporale di una retina di topo isolata. Inizia identificando un punto sulla cornea dorsale vicino al bordo della cornea sclera e tra il canto nasale e temporale.

Toccare la cornea con una penna cauterica riscaldata per meno di un secondo per creare un segno di bruciatura a scopo di orientamento. Ripetere per il secondo occhio. La presenza dell'ustione dorsale consente l'identificazione del muscolo retto superiore.

Per l'enucleazione, utilizzare una pinza curva per spingere delicatamente l'occhio fuori dalla sua orbita e afferrare il globo da sotto. Quindi, sollevare lentamente il globo dalla sua presa e contemporaneamente spostarlo delicatamente da sinistra a destra fino a quando il globo non viene rilasciato dalla presa. Trasferire il globo con i muscoli retti attaccati in una capsula di Petri contenente terreno di dissezione.

Se lavori con entrambi gli occhi, assicurati di tenere traccia di quale occhio è l'occhio sinistro e quale è l'occhio destro. Sotto l'endoscopio di dissezione, localizzare visivamente l'ustione corneale dorsale e identificare il muscolo retto superiore a cui è associata. Usando le forbici da dissezione o un ago calibro 20, perforare la cornea in corrispondenza del segno di bruciatura.

Quindi, eseguire un profondo taglio di sollievo nel globo verso il nervo ottico per dividere in due il muscolo superiore. Qui si vede una retina isolata con questo taglio, mentre qui viene mostrata la retina ricostruita con questo taglio. Usa due serie di pinze per iniziare a isolare la retina strappando delicatamente il foro praticato con la puntura fino a quando parte della retina non è esposta.

Quindi, separare la retina dalla sclera fino a quando la sclera non è stata completamente rimossa. Rimuovere l'iride, il cristallino, il vitreo e tutte le strutture rimanenti fino a quando la retina non è completamente isolata. La presenza di un'ustione dorsale consente l'identificazione della fessura coroide nasale e temporale.

Se si lavora con l'occhio destro, la fessura coroide nasale si trova a destra dell'ustione e la fessura coroide temporale si trova a sinistra dell'ustione. Questo è l'opposto del lavoro con l'occhio sinistro. Per utilizzare il punto di riferimento della ragade coroidea per identificare l'orientamento della retina, individuare e identificare la fessura coroidea sul retro dell'occhio.

Orientare il globo in modo che il segno di bruciatura dorsale si trovi al polo superiore, come sarebbe se l'occhio fosse ancora nel topo. Quindi, usa le forbici da dissezione o un ago calibro 20 per fare una puntura nel globo, prima dove si trova l'ustione dorsale. Quindi, eseguire un taglio di sollievo poco profondo verso il nervo ottico dove si trova l'ustione corneale dorsale.

Quindi, eseguire i seguenti due profondi tagli di sollievo verso il nervo ottico. Uno allineando le lame delle forbici da dissezione con la linea della fessura coroide temporale sul retro dell'occhio, e uno allineando le lame delle forbici da dissezione con la linea della fessura coroide nasale sul retro dell'occhio. Questi tagli sono mostrati qui su una retina isolata e ricostruita.

Dopo aver effettuato questi tagli, utilizzare due serie di pinze per strappare delicatamente i fori di puntura fino a quando parte della retina non è esposta. Usando le forbici da dissezione, fai quattro tagli di sollievo nella retina in modo che rimanga piatta. Montare la retina, con le cellule gangliari rivolte verso l'alto, sulla membrana di nitrocellulosa premendo delicatamente ogni angolo della retina sulla membrana con una pinza.

Quindi, utilizzare una pinza per immergere la retina montata in un millilitro di paraformaldeide al 4% contenuta nel primo pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Posizionare la piastra a 24 pozzetti su un agitatore orbitale a temperatura ambiente e fissare la retina per esattamente 40 minuti. Dopo il fissaggio, trasferire la retina nel secondo pozzetto della piastra, che viene riempito con un millilitro di PBS molare 0,1 e lavare la retina per 15 minuti a temperatura ambiente.

Al termine del lavaggio, trasferire la retina montata nel quinto pozzetto contenente un millilitro di soluzione bloccante e incubare per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, aggiungere l'anticorpo primario anti-S-opsina di coniglio alla soluzione bloccante a una concentrazione da uno a 500 e incubare per tre giorni a quattro gradi Celsius. Dopo i tre giorni di incubazione, lavare l'anticorpo primario in eccesso dalla retina sei volte posizionandolo in sequenza in sei pozzetti riempiti con un millilitro di PBS per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente.

Quindi posizionare la retina lavata in un pozzetto con una soluzione bloccante fresca e aggiungere l'anticorpo secondario Alexa 594 anti-coniglio d'asino. Incubare la retina con l'anticorpo secondario durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, lavare la retina in PBS sei volte, come in precedenza.

Usando una pinza, trasferire la retina montata in una capsula di Petri contenente PBS. Rilasciare la retina dalla membrana di nitrocellulosa inserendo delicatamente le punte delle pinze tra la retina e la membrana fino a quando la retina non è più attaccata. Immergere un vetrino da microscopio in vetro nel PBS e montare la retina sul vetrino facendola galleggiare sul vetrino e punzecchiandola delicatamente con una pinza fino a quando la retina non si attacca al vetro.

Coprire la retina sul vetrino con un mezzo di montaggio e posizionare un vetrino coprioggetti da 1,5. Metti il vetrino in un vassoio per vetrini e lascialo riposare a temperatura ambiente per un'ora. Dopo un'ora, posizionare il vassoio per vetrini a quattro gradi Celsius.

Dopo che il vetrino è stato scivolato per 24 ore, utilizzare lo smalto per unghie per sigillare i lati del vetrino per evitare l'essiccazione. Questo è un esempio di retina isolata dall'occhio destro che è stata immunocolorata per marcare la S-opsina e visualizzata con un microscopio a epifluorescenza. È importante notare che i tagli in questa retina sono arbitrari poiché l'orientamento topografico può essere identificato dal gradiente S-opsina.

L'immagine acquisita della retina può quindi essere ricostruita digitalmente con il software ReadiStruct. I tagli originali sono pseudo-colorati di rosso in questa immagine. Si noti che il file di output di questo programma non allinea correttamente la retina.

Dopo che la retina è stata analizzata attraverso il codice di laboratorio mat personalizzato, la retina viene ruotata in modo che la massima concentrazione di colorazione S-opsina venga posizionata nella parte inferiore e identificata come retina ventrale. Questa immagine mostra la retina di un occhio sinistro. Il polo temporale si trova a 90 gradi in senso antiorario dal polo ventrale e il polo nasale si trova a 90 gradi in senso orario dal polo ventrale.

Una volta padroneggiate, queste tecniche di dissezione possono essere eseguite piuttosto rapidamente in pochi minuti se eseguite correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come orientare in modo accurato e affidabile la retina del topo utilizzando il muscolo retto superiore, la fessura coroide o il gradiente S-opsina come punto di riferimento.