Protocollo sperimentale per l'esame di profili di risposta comportamentale nel pesce larvale: applicazione alla caffeina Neuro-stimolante
July 24th, 2018
Qui, presentiamo un protocollo per esaminare larvale attività locomotrice di zebrafish e fathead minnow e photomotor risposte (PMR) utilizzando un software di rilevamento automatizzato. Quando incorporata in comune con le analisi biologiche tossicologia, analisi di questi comportamenti forniscono uno strumento diagnostico per esaminare chimico bioattività. Questo protocollo è descritto usando caffeina, un modello neurostimolante.
I modelli di pesci hanno molti vantaggi e di conseguenza sono sempre più utilizzati nelle scienze biomediche. Dallo sviluppo alla scoperta di farmaci e agli studi tossicologici. Allo stesso modo, il comportamento dei modelli ittici viene sempre più utilizzato per la ricerca ambientale e biomedica.
Qui è particolarmente importante sfruttare decenni di esperienza di ricerca in tossicologia acquatica ed ecologia comportamentale per far progredire le scienze biomediche ambientali. Il nostro metodo potrebbe essere utilizzato per comprendere le bioattività delle sostanze chimiche e i benefici e i rischi che possono presentare. Il vantaggio principale di questo protocollo è quello di fornire un approccio sensibile e rapido per comprendere le attività chimiche diagnostiche utili per le scienze ambientali e biomediche.
Le implicazioni di questa tecnica hanno lo scopo di supportare la diagnosi di bioattività commerciali ed effetti comportamentali. La maggior parte di queste sostanze chimiche spesso manca di importanti informazioni sulla tossicità. Tuttavia, può essere applicato anche per comprendere gli effetti di altre sostanze chimiche come prodotti farmaceutici e pesticidi.
Questo aspetto è importante da considerare poiché i dati comparativi di farmacologia ambientale e tossicologia sono spesso carenti per i composti industriali. Oltre a misurare l'attività locomotoria larvale durante l'alterazione dei periodi fotografici chiari e scuri, questo protocollo può essere utilizzato per misurare le risposte fotomotorie larvali. Che esaminano efficacemente l'entità della differenza di movimento tra le transizioni tra luce e buio e tra buio e luce.
Per iniziare, sciogliere la caffeina in acqua dura ricostituita. Quindi eseguire diluizioni seriali per produrre livelli di trattamento con caffeina più bassi. Per preparare le singole camere di esposizione, versare 20 millilitri di soluzione in quattro becher di vetro da 100 millilitri per il pesce zebra.
Versare 200 millilitri di soluzione in tre becher di vetro da 500 millilitri per i pesciolini grassi. Successivamente, utilizzare una pipetta di trasferimento per posizionare 10 embrioni di zebrafish di età compresa tra quattro e sei ore dopo la fecondazione in ciascuno dei becher. Utilizzando una pipetta di trasferimento modificata, inserire 10 larve di minnow fathead di età compresa tra 24 ore dalla schiusa in ciascuna delle camere di esposizione.
Metti le camere del pesce zebra e del pesciolino grasso in un'incubatrice. Dopo 96 ore, caricare i singoli pesci in pozzetti separati di piastre da 48 e 24 pozzetti. Posizionare una piastra a pozzetti con almeno un pesce larvale nella camera di registrazione.
Quindi, nel software di tracciamento video, fare clic su Protocollo di generazione file. Nel campo del conteggio delle posizioni della finestra di dialogo, immettere il numero di singoli pozzetti della piastra a pozzetti. E fai clic OK.At parte superiore dello schermo, fai clic su visualizza a schermo intero.
Per visualizzare una vista della telecamera dall'alto della piastra del pozzetto. Quindi fare clic sull'icona delle aree di disegno. Selezionare l'icona del cerchio nel campo con l'etichetta aree.
Utilizzando il cursore, delineare l'area di tracciamento video circolare del pozzetto in alto a sinistra della lastra. Seleziona il segno in alto a destra e delinea l'area di visualizzazione del pozzetto in alto a destra. Quindi seleziona il segno inferiore per delineare bene il pozzetto in basso a destra.
Dopo aver definito le aree di tracciamento dei pozzi, fare clic su Costruisci per richiedere al software di delineare le aree di visualizzazione dei pozzi rimanenti. Nell'area di calibrazione, fare clic su Disegna scala e tracciare una linea orizzontale attraverso la piastra. Una volta tracciata la linea, verrà visualizzata una finestra di dialogo con l'etichetta Misurazione della calibrazione.
Immettere la lunghezza della piastra del pozzetto in questa casella e fare clic su OK. Fare clic su Applica per raggruppare nell'area di calibrazione. Per uscire dal gestore disegni, fare clic sull'icona delle aree di disegno. Quindi, fai clic sull'icona delle tessere.
Utilizzando il cursore, evidenziare tutte le caselle che appaiono sullo schermo di visualizzazione in modo che ogni casella sia verde. Fai clic su Visualizza e schermo intero. Quindi, nella casella della soglia di rilevamento, fare clic su bkg e utilizzare la barra di regolazione della soglia per impostare la soglia di rilevamento dei pixel.
Una volta selezionata la soglia appropriata, fare clic su Applica al gruppo. Nella casella denominata soglia di movimento, immettere i parametri di rilevamento della velocità di movimento desiderati. Una volta impostati i parametri di velocità, fare clic su Applica al gruppo.
Quindi, fai clic su Parametri protocollo dal menu a discesa. Nella finestra di dialogo, selezionare la scheda dell'ora e inserire i tempi di osservazione e integrazione. Fare clic su ok e aprire la finestra di dialogo delle impostazioni del driver della luce selezionando la guida leggera dal menu a discesa dei parametri.
Imposta la luce, la scura, i tempi del periodo della foto e l'intensità della luce per ciascun periodo della foto. Quindi fare clic su ok. Quindi salva il protocollo di osservazione.
Per prima cosa posizionare la piastra a pozzetti contenente il pesce sperimentale nella camera di registrazione comportamentale. Quindi apri il protocollo di tracciamento sviluppato in precedenza. Nel visualizzatore di tracciamento video, assicurarsi che tutte le larve siano visibili, che sia presente una sola larva in ciascun pozzetto e che i pozzetti siano allineati con le aree di osservazione definite.
Quindi fare clic su esperimento ed esegui. Specificare il nome e la posizione di salvataggio dei dati. E fai clic sull'icona delle diverse immagini dal vivo per evidenziare tutte le aree di visualizzazione predefinite.
Infine, chiudi il pannello della camera di registrazione e fai clic su sfondo seguito da avvia sul monitor del computer. Dopo 96 ore di esposizione alla caffeina, la risposta fotomotoria delle larve di minnow è stata alterata dalla caffeina a livelli inferiori rispetto al pesce zebra. Tuttavia, un numero marcatamente maggiore di punti finali del fotomotore è stato colpito nel pesce zebra.
Inoltre, l'attività locomotoria chiara e scura è stata analizzata attraverso tre soglie di velocità per la distanza percorsa, il numero di movimenti e la durata dei movimenti. In entrambe le specie, la caffeina ha inibito l'attività in tutti i punti finali locomotori significativamente influenzati. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di collegare i saggi comportamentali con una finestra di tempo ristretta e specifica.
Perché l'ora del giorno può influenzare i comportamenti dei pesci larvali. Seguendo questa procedura, i metodi possono essere applicati a linee guida standardizzate in altre sostanze chimiche per rispondere a ulteriori domande relative ai comportamenti dei pesci. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come osservare i comportamenti e le risposte fotomotorie dei modelli di pesci larvali durante l'esecuzione di saggi biologici di tossicità con linee guida standardizzate rilevanti per le scienze ambientali e biomediche.
Non dimenticare che lavorare con determinate sostanze chimiche può essere pericoloso, quindi assicurati di indossare dispositivi di protezione individuale adeguati durante l'esecuzione di questo protocollo.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per esaminare le attività locomotorie e le risposte fotomotorie di pesci zebra larvali e fathead minnows utilizzando software di tracciamento automatizzato. Il metodo mira a migliorare i biosaggi tossicologici fornendo informazioni sulla bioattività chimica, esemplificate attraverso l'uso della caffeina come modello di neurostimolante.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Ecologia comportamentale
- Tossicologia acquatica
- Ricerca biomedica
Contesto
- I modelli di pesce sono sempre più utilizzati nelle scienze biomediche.
- Gli studi comportamentali sui pesci possono fornire informazioni sulla ricerca ambientale e biomedica.
- Comprendere le bioattività chimiche è cruciale per valutarne i benefici e i pericoli.
- Spesso mancano dati comparativi sulla farmacologia ambientale e tossicologia.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo sensibile e rapido per valutare le attività chimiche.
- Supportare la diagnosi di bioattività commerciali ed effetti comportamentali.
- Fornire un approccio standardizzato per valutare gli effetti di varie sostanze chimiche.
Metodi utilizzati
- Sciogliere la caffeina in acqua dura ricostruita per l'esposizione.
- Utilizzare software di tracciamento automatizzato per analizzare le risposte locomotorie e fotomotorie.
- Condurre diluizioni seriali per valutare diverse concentrazioni di caffeina.
- Monitorare il comportamento dei pesci larvali durante i cicli di luce e oscurità.
Risultati principali
- La caffeina ha alterato le risposte fotomotorie nei fathead minnows a livelli inferiori rispetto ai pesci zebra.
- I pesci zebra hanno mostrato un maggior numero di endpoint fotomotori influenzati.
- Entrambe le specie hanno mostrato un'attività inibita in tutti gli endpoint locomotori.
- L'ora del giorno influenza significativamente i comportamenti dei pesci larvali.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un quadro per valutare gli effetti comportamentali delle sostanze chimiche.
- I metodi possono essere standardizzati per altre sostanze chimiche per esplorare ulteriori domande.
- Questo approccio migliora la comprensione del comportamento dei pesci negli studi tossicologici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid behavioral profiling of larval fish to assess neuroactive compound effects, supporting early-stage target validation in neuropharmacology. By quantifying photomotor and locomotor responses, it provides mechanistic insights that aid in de-risking CNS-active compounds before mammalian testing. The comparative sensitivity between zebrafish and fathead minnows offers a translational advantage for species-specific behavioral screening in environmental and biomedical contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring neurostimulant-induced behavioral changes in larval fish models.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantifiable photomotor and locomotor endpoints.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds with significant behavioral effects at environmentally relevant concentrations.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated behavioral assays for downstream compound screening using automated tracking.
- Quantitative Outputs: Generates measurable locomotor and photomotor data across speed thresholds for hit confirmation.
- Reproducibility: Standardizes light/dark cycle protocols to ensure consistent behavioral readouts across experiments.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models neuropharmacological responses relevant to CNS disorder target engagement.
- Translational Continuity: Bridges behavioral ecotoxicology with biomedical screening through conserved behavioral endpoints.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by highlighting species-specific sensitivity differences in neuroactive compound responses.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting hypothesis testing and lead identification through behavioral phenotyping of larval fish exposed to neuroactive compounds.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification by linking compound exposure to altered photomotor and locomotor behaviors.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible behavioral readouts for compound effect comparison.
- Analytics: Provides quantitative movement thresholds and photomotor response metrics for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects behavioral ecotoxicology to preclinical neuropharmacology via conserved behavioral assays.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable behavioral profiling platform applicable to diverse chemical libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in neuroactive compound screening.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability of behavioral assays across species and laboratories.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of CNS-active compounds.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization based on quantitative behavioral effect thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in larval fish husbandry and behavioral tracking software operation.
- Dependent on automated video tracking systems and controlled environmental incubators.
- Necessitates cross-team standardization of exposure protocols and behavioral endpoint definitions.
- Must account for diurnal behavioral variability when scheduling assays.
- Limited to behavioral endpoints; does not replace mechanistic or molecular target validation.
