Screening dei genotipi del cotone per la Resistenza ai Nematode Reniforme

Qui viene presentato un protocollo per il rapido screening non distruttivo dei genotipi di cotone per la resistenza ai nematodi reniformi. Il protocollo prevede l'esame visivo delle radici delle piantine di cotone infettate dal nematode per determinare la risposta all'infezione. Il germoglio vegetativo di ogni pianta viene quindi propagato per recuperare gli impianti per la produzione di semi.

Questo metodo potrebbe aiutare nello sviluppo di varietà di cotone resistenti ai nematodi reniformi. Attraverso l'identificazione di genotipi resistenti di altre specie di cotone e la valutazione delle popolazioni riproduttori. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un metodo semplice e non distruttivo per lo screening del nematode reniforme.

Inizia posizionando una palla di cotone nella parte inferiore di un diametro di quattro centimetri, 21 vasi di plastica conici di altezza centrale per seme. E riempire le pentole con miscela di terreno pastorizzato a vapore a circa due centimetri dalla parte superiore della pentola. Mettere un paletto di plastica in ogni vaso che designa il genotipo da piantare e piantare un seme del genotipo di cotone corrispondente appropriato in ogni pentola.

Riempire ogni pentola con terreno aggiuntivo per coprire il seme e posizionare i vasi in una camera di crescita impostata a temperatura costante di 28 gradi Celsius con un periodo fotografico di lampada fluorescente e a incandescenza di 16 ore. Quindi posizionare gli emettitori d'acqua in ogni pentola e utilizzare un sistema di irrigazione automatico per innaffiare le pentole due volte al giorno. Sette giorni dopo la semina, creare una piccola depressione nel terreno accanto a ogni pianta e aggiungere un millilitro di sospensione nematode reniforme in ogni depressione.

Dopo l'inoculazione, l'acqua della pentola deve essere attentamente controllata per evitare il lavaggio dei nematodi dalla zona radicale. 28 giorni dopo l'inoculazione, utilizzare le forbici per rimuovere la maggior parte delle foglie completamente espanse dalle piante prima di spremere ogni pentola e far scivolare il terreno in una mano per rimuovere le piante. Agitare delicatamente il sistema radicale in acqua del rubinetto in un contenitore da 10 litri per rimuovere il terreno dalle radici, seguito da un breve risciacquo in un contenitore di acqua pulita del rubinetto.

Utilizzare le forbici per rimuovere il sistema radicale pulito dalla pianta circa un centimetro sotto la linea del terreno. Posizionare le radici in un contenitore di plastica da 120 millilitri non sterile. Successivamente, coprire completamente il sistema radicale con circa 30 millilitri di soluzione colorante per alimenti rossi e posizionare il contenitore del campione in un forno a microonde per il riscaldamento della soluzione di colorazione fino a quando non inizia a bollire.

Quando il campione si è raffreddato a temperatura ambiente, sostituire la soluzione colorante per alimenti rossi con 100 millilitri di acqua del rubinetto per rimuovere eventuali macchie in eccesso. Quindi posizionare il coperchio sul contenitore del campione e conservare il campione a quattro gradi Celsius fino all'analisi dell'infezione alla radice. Per recuperare le piante per la produzione di semi, posizionare una palla di cotone sul fondo di una nuova pentola di plastica conica e riempire parzialmente la pentola con mezzo di invaso di muschio di torba.

Posizionare un sistema radicale raccolto germogli vegetativi nella pentola e aggiungere saldamente il mezzo di invaso per riempire la pentola. Posizionare un nuovo palo di plastica etichettato in ogni pentola per designare il genotipo di cotone e posizionare il vassoio dei vasi in un contenitore di plastica d'acqua. Innaffiare brevemente le piante per inumidire il mezzo di invaso e posizionare i vasi in una camera di crescita impostata a una temperatura costante di 28 gradi Celsius e un periodo fotografico di 16 ore.

Dopo circa 30 giorni, riempire parzialmente una pentola di plastica da sei litri per pianta con mezzo di invaso. Trasferire ogni pianta in una pentola da sei litri, aggiungendo saldamente mezzo di invaso a ogni pentola mentre ogni piantina viene piantata. Quindi posizionare le piante in una casa di vetro e aggiungere acqua per inumidire il mezzo di invaso.

Per valutare l'infezione alla radice di R.reniformis, rimuovere un campione di radice dal contenitore del campione. Utilizzare un microscopio stereo per contare il numero di nematodi femminili collegati al sistema radicale con ingrandimento 20X. Un'infezione del sistema radicale nematode di successo può essere influenzata da diversi fattori, tra cui la vitalità del nematode utilizzato per l'inoculazione e la variazione stagionale, poiché i nematodi sono meno attivi durante i mesi invernali.

Quindi posizionare il sistema radicale su tovaglioli di carta per circa 10 minuti per rimuovere l'umidità in eccesso. Pesare il sistema radicale per determinare il peso della radice fresca. Le variazioni nella crescita delle radici sono comuni tra le escizioni.

Queste variazioni, misurate dal peso delle radici fresche, possono anche essere osservate tra piante dello stesso genotipo. Relativamente meno nematodi reniformi femminili sono in grado di stabilire un sito di alimentazione per il genotipo di cotone resistente rispetto al genotipo suscettibile. I nuovi dati sul peso delle radici possono essere utilizzati per calcolare il numero di nematodi reniformi femminili per grammo di tessuto radicale per ogni genotipo.

Il numero di nematodi reniformi femminili per grammo di radice per genotipi resistenti è generalmente inferiore a 10, mentre i genotipi sensibili hanno in genere più di 30 nematodi per grammo di radice. Qui viene mostrato un sottoinsieme di dati provenienti da una popolazione F2 segregata che includeva 300 piante. Questi intervalli di variazione per la crescita delle radici e l'infezione da nematodi dei sistemi radicale sono comunemente osservati per le valutazioni dei nematodi, illustrando la capacità di questa procedura di essere utilizzata per osservare un gran numero di piante in un singolo esperimento, per ridurre al minimo questa variazione e per facilitare una valutazione accurata della genetica della resistenza.

Seguendo questa procedura, la genetica della resistenza al nematode reniforme può essere determinata per identificare i marcatori di DNA associati alla resistenza. Questi marcatori possono quindi essere utilizzati per l'allevamento assistito da marcatori e per il trasferimento della resistenza al nematode al cotone di montagna. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha fornito un metodo non distruttivo per consentire ai ricercatori di recuperare le piante dopo il ri-screening del nematode per aiutare nell'allevamento di varietà di cotone resistenti.