RNAi di screening per identificare fenotipi postembrionale in C. elegans

L'obiettivo di questa procedura è quello di identificare regolatori post-embrionali dell'espressione e della localizzazione proteica in C elegance utilizzando uno screening genomico basato su RNAi e proteine marcate in fluorescenza. Una volta costruito il ceppo di screening appropriato, viene scelta una libreria di RNAi. Il primo passo della procedura consiste nel confezionare i cloni della libreria in batteri.

I batteri vengono quindi selezionati, cresciuti e nutriti con nematodi c elegance in stadi. Dopo aver lasciato crescere i nematodi per 72 ore, vengono osservati per alterazioni del fenotipo di interesse. Infine, i cambiamenti nell'espressione o nella localizzazione subcellulare della proteina attaccata vengono visualizzati con la microscopia a fluorescenza.

Questo metodo è in grado di identificare i geni necessari per la corretta localizzazione subcellulare di una proteina marcata in fluorescenza. Tuttavia, questo protocollo può essere modificato per identificare i geni che influenzano altri fenotipi post-embrionali di interesse. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai protocolli esistenti pubblicati è che abbiamo ottimizzato la consistenza e il livello della risposta RNAi negli animali inducendo la produzione dell'RNA a doppio filamento nei batteri prima della placcatura.

A dimostrare la procedura sarà Kathy Fuss, una ricercatrice associata del mio laboratorio Entro due mesi dall'inizio dell'esperimento, preparerà la libreria di cloni di prima striscia di batteri da cloni selezionati della libreria di alimentazione, nonché controlli positivi e negativi su piastre di tetraciclina carbonica LB. Per un controllo positivo, utilizzare un clone contenente un gene che produce un fenotipo post-embrionale dose-dipendente, come BLE four. Per un controllo negativo, utilizzare un vettore vuoto o un clone contenente uno pseudogene previsto senza fenotipi osservati.

Incubare le piastre per una notte per ogni clone, inoculare due millilitri di terreno LB contenente 50 microgrammi per millilitro. L'acido carbonico con una singola colonia dalle piastre di striatura, incuba le colture durante la notte con agitazione la mattina successiva. Le soluzioni dovrebbero essere indotte dalla torbidità nella produzione di RNA a doppio filamento aggiungendo IPTG alle colture e incubarle per altre quattro o cinque ore nelle stesse condizioni.

L'aggiunta di IPTG garantisce un knockdown del prodotto genico indotto da RNAI più coerente e robusto rispetto all'affidarsi esclusivamente all'IPTG e alla coclea della piastra NGM Dopo l'incubazione dell'IPTG Individuare 30 microlitri di coltura da ciascun clone in ciascun pozzetto delle piastre NGM RNAi a 24 pozzetti preparate. Un clone per pozzetto. Ogni piastra dovrebbe avere due pozzetti dedicati ai controlli.

Individua attentamente l'ubicazione di ogni biblioteca. Clonare nelle piastre a 24 pozzetti posizionare ora le piastre scoperte in una cappa a flusso sterile per asciugare per circa 20 minuti. Non lasciare che i bordi dell'agar si stacchino dalla piastra.

Una volta essiccati i nematodi in stadi alle piastre, vengono fornite le istruzioni sulla preparazione dei nematodi. Nella sezione successiva, inizia con una popolazione in stadi di primo stadio larvale o nematodi L uno. A partire da L uno, le larve bypassano i potenziali fenotipi letali embrionali.

Avere una popolazione di animali da sottoporre a screening aumenta anche la fiducia che le variazioni osservate siano dovute all'RNAi e non siano semplicemente variazioni normali che si verificano in fasi diverse. Tuttavia, se l'RNAi causa un ritardo dello sviluppo, questo dovrebbe essere notato dallo screener Bleach. Una popolazione in stadio misto del ceppo di screening.

Solo gli embrioni protetti dal guscio d'uovo sopravviveranno a questa fase, stadi degli animali entro 12 ore se condotti a 20 gradi Celsius o entro 18 ore. Se condotto a 16 gradi Celsius il giorno in cui vengono inoculate le colture batteriche. Seleziona tre piastre da 100 millimetri di animali del ceppo di screening che siano sani e contengano sia gravità, adulti ed embrioni.

Lavare tutti gli animali in terreno sterile M nine e trasferire il lavaggio in un tubo sterile da 15 millilitri con tappo a vite. Se il lavaggio è superiore a 3,5 millilitri, centrifugare sugli animali e rimuovere tutto tranne 3,5 millilitri di liquido. Se inferiore a 3,5 millilitri.

Aumentare il volume a 3,5 millilitri con acqua o M nove per liberare gli embrioni dagli adulti a 1,5 millilitri di una miscela di idrossido di sodio e candeggina ad ogni lavaggio. Lasciare incubare gli animali per non più di 10 minuti in questa soluzione. Dopo aver avviato un timer, fai vorticare ogni tubo per 10 secondi e ripeti il vortice ogni due minuti.

Dopo ogni vortici, osservare la soluzione sotto un cannocchiale da dissezione per carcasse di animali. Entro sei-otto minuti, gli adulti saranno frammentati e gli embrioni dovrebbero essere rilasciati. Rimuovere gli embrioni dalla soluzione di candeggina pellettandoli e rimuovendo quanto più surnatante possibile senza disturbare il pellet.

Quindi risospendere il pellet in un volume di 10 millilitri aggiungendo M nine sterile e agitandolo. Ripeti questo processo di lavaggio almeno un'altra volta fino a quando l'odore di candeggina non è completamente impercettibile. Per una stadiazione più stretta, gli animali li arrestano nel loro stadio L uno schiudendo gli embrioni in mezzo M nove senza cibo.

Questo viene fatto trasferendo gli embrioni in M nove in un piccolo pallone di erlenmeyer. Agitare il pallone per una notte alla temperatura corretta per il ceppo e sperimentare. In questo periodo, tutti gli animali si schiudono e si arrestano nella diapausa L one il giorno successivo.

Riprendere la crescita delle larve da un determinato punto temporale trasferendole ai batteri preparati che esprimono RN a doppio filamento. Questo è lo stesso giorno in cui le piastre da 24 pozzetti sono state macchiate di batteri. Inizia trasferendo gli animali L one in un tubo da 15 millilitri e facendoli girare verso il basso. Quindi concentrare gli animali in mezzo o un millilitro di M nove e posizionare cinque microlitri di nematodi concentrati su un piatto.

Contare il numero di animali sulla piastra e regolare la soluzione concentrata di nematodi. TE 30 vermi ogni 3-10 microlitri. Infine, individuare circa 30 L di animali in uno stadio sui batteri in ogni pozzetto del preparato.

Piastra a 24 pozzetti Più di 30 animali per pozzetto possono provocare la fame Dopo che le macchie si sono asciugate, il che richiederà alcuni minuti, fissare il coperchio con l'elastico incubare gli animali capovolti alla temperatura e alla durata richieste per segnare gli animali allo stadio desiderato. Una volta che i nematodi sono pronti per lo screening, confermare che i controlli positivi e negativi producano i fenotipi attesi. Quindi osserva gli animali da esperimento per anomalie dello sviluppo.

Successivamente, utilizzando un microscopio da dissezione, montare da otto a 12 animali da ciascun pozzetto su vetrini in PET al 4% di Agri con una goccia di cinque microlitri di anestetico. Dopo aver applicato il vetrino coprioggetto appropriato, osservare almeno cinque animali utilizzando la microscopia composta. Mantieni un database organizzato del gene, del numero di animali osservati e dei risultati fenotipici.

Per ogni esperimento RNAI, verificare qualsiasi fenotipo prodotto da R RNAi con un altro fenotipo secondario, se possibile, e ripetendo l'esperimento, esperimenti ripetuti possono utilizzare batteri della stessa striscia. Le striature più vecchie possono causare una scarsa crescita nelle colture liquide durante la notte e dovrebbero essere rifatte prima con le strisce. Alcune colture batteriche non crescono bene a causa del prodotto genico espresso nel loro plasmide.

In questo caso, è sufficiente concentrare i batteri prima della placcatura. Per uno screening continuo, è importante mantenere molti embrioni sempre pronti per la stadiazione. Il ceppo di screening deve essere sempre nutrito, non affamato e privo di contaminanti che possono influenzare il fenotipo di interesse.

Abbiamo stabilito un programma di manutenzione per l'alimentazione degli animali. I geni che influenzano la localizzazione di DBL 1 sono stati identificati da RNAi utilizzando un design di ceppo per questo screen. L'espressione normale del tag GFP dbl one include corpi cellulari del cordone nervoso ventrale e una fila di animali puncti alimentati con RA antisenso a DBL.

Un mRNA ha mostrato un'espressione gravemente attenuata di DBL uno. Questi animali erano anche piccoli come gli animali privi di DBL L funzionale. Lo screening dell'RNA I ha identificato con successo molti altri geni i cui prodotti influenzano la localizzazione di DBL 1, ampliando così la nostra comprensione di come il TGF beta viene trafficato subcellulare e fornendo un punto di partenza per molte altre indagini.

Utilizzando questo metodo, una singola persona può ragionevolmente mettere in scena e osservare da due a quattro serie di esperimenti ogni settimana. Ad esempio, gli animali in sosta il lunedì e il martedì possono essere osservati rispettivamente il giovedì e il venerdì, e gli animali possono essere nuovamente allestiti il venerdì e il sabato per il lunedì e il martedì. Osservazione Seguendo questa procedura su tutto lo schermo.

È importante mantenere un gran numero di embrioni pronti per la stadiazione, quindi mantieni regolarmente il ceppo di screening. Inoltre, è importante prendere appunti dettagliati su tutte le osservazioni.