Saggio di screening dei nematocidi di piccole molecole: un metodo a medio rendimento per lo screening di potenziali nematocidi contro Ditylenchus dipsaci

I nematodi parassiti delle piante come il Ditylenchus dipsaci sono vermi microscopici. I vermi vivi mostrano movimenti sinusoidali attraverso le contrazioni muscolari e la loro motilità è un importante determinante della loro salute in condizioni di coltura.

L'esposizione ai nematocidi, sostanze chimiche tossiche, può interferire con i processi biologici chiave, influenzando la mobilità di questi nematodi coltivati, portandone alla morte.

Per lo screening di nematocidi a piccole molecole, prendere una piastra multipozzetto contenente acqua distillata. Utilizzando uno strumento di pinning pulito, trasferire i potenziali piccoli nematocidi molecolari dalla piastra madre chimica alla piastra di analisi per garantire un trasferimento di quantità costanti di molecole in ciascun pozzetto.

Erogare un numero uguale di nematodi in ogni pozzetto della piastra. Sigillare le piastre mantenendo le condizioni di umidità per supportare la sopravvivenza e la mobilità dei nematodi. Incubare la piastra con una leggera agitazione per evitare che i vermi si depositino.

Durante l'incubazione, varie piccole molecole tossiche agiscono sui vermi e li uccidono, mentre quelle non tossiche non hanno alcun impatto. Osservare la piastra al microscopio da dissezione per identificare i pozzetti con una popolazione di vermi non mobili.

Integrare le piastre di analisi con una soluzione di idrossido di sodio - stimolante chimico end-point. Questo innesca il movimento di tutti i vermi a riposo e li differenzia da quelli morti.

La presenza di vermi non mobili dopo il trattamento con idrossido di sodio in alcuni pozzetti conferma l'efficacia delle corrispondenti piccole molecole come nematocidi.

Per preparare le piastre di analisi, versare acqua distillata autoclavata in un trogolo sterile ed erogare 40 microlitri di acqua distillata dal trogolo in ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti con una pipetta multicanale. Aggiungere le sostanze chimiche dalle piastre di alimentazione chimica a 96 pozzetti alle piastre di analisi, fissandole tre volte nella piastra chimica. Quindi, trasferire i perni 10 volte nella piastra di analisi. Tamponare sulla carta davanti alla soluzione detergente.

Per contare il numero di nematodi della raccolta, prima risospendere la raccolta, quindi pipettare 5 microlitri di soluzione utilizzando puntali a bassa ritenzione su un vetrino. Contare il numero di nematodi in 5 microlitri utilizzando un microscopio da dissezione. Quindi, regolare la concentrazione a due vermi per microlitro utilizzando acqua distillata sterile.

Quindi, aggiungere 10 microlitri di campione a ciascun pozzetto delle piastre da 96 pozzetti con una pipetta multicanale e un trogolo. Avvolgere i piatti con un tovagliolo di carta umido e metterli in una scatola. Quindi, aggiungere un tovagliolo di carta umido extra per stabilizzare e garantire il minimo movimento delle piastre e applicare su un tampone adesivo in un'incubatrice con agitazione a 20 gradi Celsius impostata a 200 giri/min.

Osserva le piastre il giorno 5 al microscopio da dissezione. Contare il numero di D. dipsaci mobili e totali nei controlli con solvente DMSO e nei pozzetti trattati con farmaci.

Se i vermi sono immobili, aggiungere 2 microlitri di idrossido di sodio 1 molare a una concentrazione finale di 40 millimolari al pozzetto per stimolare il movimento. Calcola la percentuale di worm mobili. Negli schermi di D. dipsaci, i pozzetti che hanno prodotto in modo riproducibile lo 0% di worm mobili sono classificati come colpi forti.