Immunofluorescenza Etichettatura delle trappole extracellulari di neutrofilo umano e murino nel tessuto incorporato di paraffina

Le trappole extracellulari neutrofilo (NET) sono strutture tridimensionali generate da granulociti neutrofili stimolati. È diventato chiaro negli ultimi anni che i NET sono coinvolti in una vasta gamma di malattie. Il rilevamento di RETI nei tessuti può avere rilevanza diagnostica, quindi sono necessari protocolli standardizzati per l'etichettatura dei componenti NET.

Oggi vorremmo mostrarvi varianti del comune protocollo di recupero dell'antigene indotto dal calore. Combina i benefici di una temperatura più bassa per l'antigene neutrofilo dell'elastasi e un alto valore di pH richiesto per gli istoni. Questa tecnica consente di studiare NET, trappole extracellulari neutrofile, nei tessuti di paraffina sia da topo che da uomini.

Ed è anche considerato per studiare materiale archiviato o studio retrospettivo. In primo luogo, posizionare le diapositive preparate nei rack e sommergerle nel supporto utilizzato per la disidratazione e la compensazione in ordine inverso per cinque minuti ciascuna. Quindi, riscaldare un bagno d'acqua con una piastra calda a temperatura controllata a 70 gradi Celsius.

Posizionare un barattolo riempito con tampone di recupero dell'epitopo indotto dal calore e 10% di glicerolo nel bagno d'acqua. Quando il buffer ha raggiunto i 70 gradi Celsius, posizionare il rack con le diapositive nel barattolo del buffer. Incubare le diapositive a 70 gradi Celsius per 120 minuti.

Dopo questo, rimuovere il barattolo dal bagno d'acqua e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente. Risciacquare le sezioni raffreddate tre volte con l'acqua ionizzata e una volta con TBS. Utilizzando carta filtrante arrotolata o un batuffolo di cotone, rimuovere con cura qualsiasi liquido tra le sezioni sui vetrini, assicurandosi di lasciare le sezioni idratate.

Quindi, utilizzare una penna barriera idrofobica per creare una barriera intorno a ogni sezione. Incubare la sezione nel tampone di blocco a temperatura ambiente per 30 minuti per evitare attacchi non specifici. Diluire gli anticorpi primari nel tampone di blocco ad una concentrazione di un microgrammo per millilitro.

Rimuovere il tampone di blocco dalle diapositive e aggiungere gli anticorpi primari diluiti, assicurandosi di utilizzare un volume sufficiente per evitare l'essiccazione. Chiudere il contenitore umido e incubare durante la notte a temperatura ambiente. Il giorno successivo, lavare le sezioni tre volte con TBS ad ogni lavaggio della durata di cinque minuti.

Preparare una soluzione funzionante di anticorpi secondari nel tampone di blocco. Coprire le sezioni dei tessuti con la soluzione anticorpale secondaria e trasferire le diapositive in un contenitore umido. Sigillare il contenitore umido e incubare a temperatura ambiente per un'ora.

Successivamente, lavare le sezioni tre volte con TBS e una volta in acqua con ogni lavaggio della durata di cinque minuti. Coprire le sezioni lavate con mezzo di montaggio e applicare il vetro di copertura evitando la formazione di bolle. Dopo che il mezzo di montaggio si è solidificato, utilizzare un microscopio confocale o un microscopio a campo largo con filtri passa banda appropriati per analizzare l'immunofluorescenza.

Per digitalizzare le sezioni complete utilizzando uno scanner di diapositive, impostare l'intensità della fluorescenza utilizzando i controlli negativi e positivi. Utilizzando la colorazione neutrofila dell'elastasi, trovare le aree ricche di neutrofili e ingrandire quelle aree per verificare se il segnale neutrofilo elastasi è granulare o extracellulare. Se il segnale è extracellulare e si sovrappone sia alla colorazione istono che al DNA, sono state ottenute le trappole extracellulari neutrofile.

In questo studio, i componenti NET vengono rilevati con successo nel tessuto incorporato nella paraffina, sia di origine umana che murina. Se le sezioni tissutali hanno uno spessore compreso tra due e tre micrometri, possono essere analizzate mediante microscopia a campo largo utilizzando obiettivi 10x o 20x. Per valutare correttamente la colorazione, sono stati elaborati campioni sia negativi che positivi.

Una sezione rappresentativa del tessuto dell'appendicite umana mostra tessuti macchiati per NE, H2B e Hoechst 33342. Le immagini a sinistra provengono da un'area della sezione contenente NET, mentre le immagini a destra provengono da un'area diversa della stessa sezione che contiene numerosi neutrofili ma nessun NET. Le aree con formazione massiccia di NET possono essere facilmente trovate anche a bassi ingrandimenti poiché tutti e tre i componenti NET colocalizzano spesso in strutture extracellulari filanti.

Questo appare nella sovrapposizione dei tre canali come fibre extracellulari biancastre che possono essere quantificate utilizzando il software di analisi delle immagini per creare una sovrapposizione viola utilizzando pixel da segnali sovrapposti che sono positivi per verde, rosso e blu. Per una risoluzione più elevata, i microscopi confocali o i microscopi a campo largo con deconvoluzione devono essere utilizzati per ridurre al minimo la sfocatura fuori fuoco. Una proiezione massima di una pila confocale di un'area ricca di NET dallo stesso campione di appendicite umana mostra che la NE si trova nei granuli ma è anche abbondante extracellularmente dove colocalizza con H2B e con DNA.

La colocalizzazione extracellulare si traduce in una combinazione di colori biancastri. I pixel positivi per il verde, il rosso e il blu possono essere utilizzati ancora una volta per creare una sovrapposizione viola che presenta i NET. Un dettaglio rappresentativo di una sezione centrale di un polmone di topo infettato da Mycobacterium tuberculosis fornisce un altro esempio della colocalizzazione di tutti e tre i componenti NET chiaramente visibili come aree biancastre tra neutrofili che possono essere utilizzate per creare uno strato viola che indica i NET.

Durante la procedura di colorazione, le sezioni non devono asciugarsi perché ciò causerà una colorazione falso-positiva o uno sfondo alto. L'analisi del materiale archiviato può aiutare a comprendere l'impatto dei NET nelle malattie. Poiché il tessuto di paraffina può avere uno sfondo enorme, è importante avere un controllo positivo e negativo che è possibile distinguere tra la colorazione e lo sfondo.

La decerazione e la disidratazione devono essere eseguite sotto una cappa aspirante. Assicurati di indossare guanti e il cappotto da laboratorio.