Sintesi enzimatica mediata OaAEP1 e immobilizzazione delle proteine polimerizzate per la spettroscopia a singola molecola

Il nostro metodo enzimatico utilizza oligomero proteico con un numero controllato di grado di polimerizzazione. È una preparazione perfetta del campione per lo studio della spettroscopia a forza a singola molecola e per la costruzione di materiali a base proteica. Il nostro metodo non introduce la cisteina nella proteina bersaglio.

Poiché la cisteina è uno dei residui funzionali più importanti per le proteine, facilita la costruzione di proteine o enzimi della materia polimerizzata. A dimostrare la procedura saranno Yibing Deng e Shengchao Shi, studenti laureati del mio laboratorio. Per iniziare, sciogliere 20 grammi di cromato di potassio in 40 millilitri di acqua ultrapura in un bicchiere.

Aggiungere lentamente 360 millilitri di acido solforico concentrato alla soluzione di dicromato di potassio e utilizzare un'asta di vetro per mescolare delicatamente. Posizionare una coverlip di vetro nell'acido cromico e trasferirla in un forno a 80 gradi Celsius per 30 minuti. Pulire il coverslip con acqua e quindi alcol etilico assoluto e asciugare il coverslip con un flusso di azoto.

Immergere completamente il coverslip in soluzione toluene APTES dell'1% volume per volume per un'ora a temperatura ambiente proteggendoli dalla luce. Lavare prima il coverslip con toluene e poi con alcool etilico assoluto e asciugare il coverslip con un flusso di azoto. Incubare il coverslip a 80 gradi Celsius per 15 minuti e quindi lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente.

Utilizzare una pipetta per aggiungere 200 microlitri da un milligrammo per millilitro Sulfo-SMCC in soluzione DMSO tra due coverslip immobilizzati e incubare per un'ora protetti dalla luce. Dopo un'ora, lavare prima le coverlips con DMSO e poi con alcol etilico assoluto per rimuovere il Sulfo-SMCC residuo. Asciugare il coverslip sotto un flusso di azoto.

Pipetta 60 microlitri di soluzione micromolare GL-ELP-50 cis-proteina su un coverslip funzionalizzato e incubare a 25 gradi Celsius per circa tre ore. Successivamente, lavare il coperchio con acqua ultrapura per rimuovere i GL-ELP-50-cy non rievocati. Per preparare la superficie a sbalzi funzionalizzata, immergere prima i cantilever in acido cromico e pulire i cantilever a 80 gradi Celsius per 10 minuti.

Utilizzare acqua e alcol etilico assoluto per lavare via l'acido. Immergere il cantilever con soluzione toluene APTES dell'1% volume per volume per eseguire l'amino salinizzazione in un tappo di tubo di plastica per un'ora. Risciacquare il sbalzino con alcol etilico assoluto e quindi cuocere il sbalzino a 80 gradi Celsius per 15 minuti.

Immergere il sbalzino nella soluzione Sulfo-SMCC per un'ora e quindi risciacquare il cantilever con alcol etilico assoluto. Per collegare il cys-ELP-50-NGL alla superficie, immergere i cantilever nel cys-ELP-50-NGL con il gruppo maleimide di Sulfo-SMCC per 1,5 ore. Quindi lavare via la cis-ELP-50-NGL non transazionale sul sbalzino con acqua ultrapura.

Successivamente, immergere un sbalzino funzionalizzato in una soluzione contenente 200 microlitri di soluzione proteica GL-CBM-XDockerin micromolare con 200 nanomolare OaAEP1 e posizionarli a 25 gradi Celsius per 20-30 minuti. Quindi utilizzare il buffer AFM per lavare via le proteine non transazionate. È fondamentale lavare via la proteina residua non transazionale prima dell'esperimento AFM perché formerà coppie coesina-dockerin e il blocco il cantilever per assumere nuove proteine sulla superficie.

Per collegare l'unità di legatura coessina-T-L-proteina di interesse-NGL al GL-ELP-50 immobilizzato sulla superficie del coverslip, aggiungere 15 microlitri di OaAEP1 sul coverslip e lasciarlo incubare per 30 minuti. Utilizzare da 15 a 20 millilitri di tampone AFM per lavare via eventuali proteine nonrie. Aggiungere 100 microlitri di proteasi TEV per scindere l'unità proteica nel sito di riconoscimento TEV per un'ora a 25 gradi Celsius.

Quindi utilizzare da 15 a 20 millilitri di tampone AFM per lavare via le proteine residue. Collegare l'unità di legazione coessina-T-L-proteina di interesse-NGL al vetro GL-ubiquitin-NGL di OaAEP1 per 30 minuti. A seconda dei costrutti proteici GL-ubiquitin-NGL da costruire sulla superficie del vetro, ripetere i passaggi di preparazione della poliproteina n1 volte.

Omettere l'ultima reazione di scissione TEV per riservare la coessina sul polimero proteico come vetro coessina-TEV-L-ubiquitina-n-NGL. Aggiungere un millilitro di tampone AFM con cloruro di calcio millimolare e cinque millimolare acido ascorbico alla camera del fluido AFM. Scegliete la punta D della sonda AFM funzionalizzata per l'esperimento.

Immergere la sonda nel buffer AFM. Ritrarre il sbalzino ad una velocità costante di 400 nanometri al secondo dalla superficie. Nel frattempo, registrare la curva di estensione della forza ad una velocità del campione di 4.000 hertz.

Usa il teorema di equipartizione per calibrare il cantilever nel buffer AFM con un accurato valore K costante della molla prima di ogni esperimento. Attaccare la punta a sbalzi funzionalizzata con dockerina alla superficie depositata proteica funzionalizzata con coessina per formare la coppia coessina-dockerin. Quindi aprire il software di elaborazione dati JPK e selezionare la curva di estensione della forza con il caratteristico modello simile a un dente di sega e un'elevata forza di distacco.

In questo studio, i residui NGL introdotti tra proteine adiacenti dalla legatura OaAEP1 non hanno influenzato la stabilità del monomero proteico nel polimero espressa in quanto la forza di dispiegamento e l'incremento della contro-lunghezza erano paragonabili allo studio precedente. La purificazione della forma ferrica rubredossina presentava tipici picchi di assorbimento visualizzazione UV a 495 nanometri e 575 nanometri mentre la forma di zinco no. I risultati del gel di pagina SDS della digestione e della legazione stepwise mostrano una TEV-L-ubiquitina coesa, la miscela proteica risultante della scissione TEV, la pura proteasi GFP-TEV e il prodotto purificato GL-ubiquitina.

Vengono mostrate anche la miscela di legatura GL-ubiquitina e coessina-TEV-L-ubiquitina con o senza OaAEP1 e OaAEP1 puro. È fondamentale funzionalizzare la superficie con Sulfo-SMCC attivo per un attacco peptidico con successo. Qui forniamo un nuovo metodo per costruire proteine polimerizzate.

Facilita ai ricercatori lo studio di un sistema proteico complesso utilizzando la spettroscopia di forza a singola molecola. L'acido cromico è fortemente corrosivo e acido. Fai attenzione quando lo prepari e lo gestisci.