Isolamento di Myofibrils da biopsie muscolari scheletriche e determinazione della funzione Contractile con un trasduttore della forza di risoluzione Nano-Newton

Presentato qui è un protocollo per valutare le proprietà contraili dei miofibrili muscolari striati con risoluzione nano-Newton. Il protocollo utilizza una configurazione con una sonda a forza ottica basata sull'interferometria. Questa configurazione genera dati con un elevato rapporto segnale-rumore e consente la valutazione della cinetica contrattinale delle miofibrils.

La valutazione delle proprietà contrattili delle miofibrille isolate dal muscolo striato può essere utilizzata per determinare se la disfunzione del sarcomero è una causa primaria di debolezza muscolare a causa di mutazioni nelle proteine sarcomeriche. Questa tecnica può essere utilizzata per acquisire dati con un rapporto segnale-rumore molto elevato con risoluzione di nanonewton. Questo protocollo è adatto anche per misurare la contrattilità nei cardiomiociti permeabilizzati.

Tieni presente che il trasduttore di forza è molto fragile. Quindi, quando si rimuove la colla dall'ago di montaggio o quando si incolla una miofibrile, è necessario avere una mano ferma, molta pratica e molta pazienza. Prima di montare il tessuto, posizionare un'asta di omogeneizzatore nel tubo contenente il tessuto muscolare.

Mantenendo il tubo sul ghiaccio, ruotare il rotore per 15 secondi sulla velocità cinque. Al termine dell'omogeneizzazione, trasferire 50 microlitri della sospensione miofibrille risultante e 250 microlitri di soluzione rilassante su uno scivolo rivestito in poli-HEMA in un bagno di tessuto. Coprire il bagno con un coperchio per proteggere la miscela dalla polvere e attendere da 5 a 10 minuti per consentire alle miofibri di affondare sul fondo della goccia.

Durante l'affondamento delle miofibrille, scaldare shellac una colla di etanolo a 65 gradi Celsius per 30-60 secondi prima di aggiungere circa sei microlitri di colla su uno scivolo di vetro non rivestito. Immergere ripetutamente la punta di ogni ago di montaggio nella colla fino a quando non è visibile uno strato di colla. Quindi utilizzare i micro manipolatori per spostare la sonda e il piezo verticalmente per fare spazio al bagno di tessuto sullo stadio del microscopio e rimuovere lo scivolo di vetro contenente la colla.

Dopo aver montato le miofibrille, per misurare la lunghezza del sarcomero, spostare la sonda piezo e/o di forza per impostare la lunghezza iniziale del sarcomero del miofibrile su 2,5 micrometri. Utilizzando la funzione di contenitore del software del controller di sistema, misurare la lunghezza e la larghezza della miofibrillazione. Utilizzare lo stadio del microscopio per posizionare la miofibrile al centro dell'immagine video e allungare un rettangolo da un lato della miofibrile all'altro, facendo attenzione a includere il bordo scuro delle goccioline di colla.

Per iniziare a registrare i dati, fare clic su Avvia. Dopo cinque secondi, fare clic su Pausa. La lunghezza sarà stata registrata.

Per misurare la larghezza, ruotare la fotocamera di 90 gradi per visualizzare il contrasto del bordo della miofibrile stessa. Regolare il rettangolo e fare clic su Avvia per iniziare a registrare i dati. Dopo cinque secondi, fare clic su Pausa.

La larghezza sarà stata registrata. Per posizionare il vetro theta, utilizzare l'oculare e il manipolatore per spostare attentamente il vetro theta verso la miofibrile. Allineare il canale superiore del vetro theta con la miofibrile ed eseguire un passo veloce per verificare la posizione.

Accendere il flusso rilassante dello sfondo per controllare l'allineamento del vetro theta e utilizzare una leva della valvola Luer per accendere l'afflusso della camera di flusso. Quindi, per iniziare a drenare la camera di flusso e per evitare lo straripamento della camera di flusso, impostare la valvola della pompa di deflusso sulla valvola da bagno due, la modalità micro step a micro, il bersaglio dello stantuffo a 48.000 e la velocità dello stantuffo a 38 a 40. Per misurare il tasso di riqualificazione della tensione, calcolare il movimento piezo necessario per rallentare la miofibrile del 15% e inserire questo valore nel generatore di segnale.

Fare clic su riprendi per continuare a registrare i dati e aprire le valvole uno e sei per avviare i flussi della soluzione rilassante e le diverse concentrazioni di calcio rispettivamente attraverso il vetro theta. Selezionate l'intervallo di reset sull'interferometro per ripristinare l'intervallo dell'interferometro in modo che la forza di base sia zero volt. Quando la traccia di forza è stabile, eseguire il fast-step in vetro theta con una dimensione del passo di 100 micrometri.

Quando si raggiunge l'altopiano di forza, eseguire il ri-allungamento accorciamento con il piezo. Verrà registrata una traccia di rilassamento dell'attivazione. Fare clic su Pausa.

Per eseguire un'estensione step-wise, fare clic su avvia e reimpostare l'intervallo dell'interferometro in modo che la forza di base sia zero volt. Eseguire un allungamento step-wise con il generatore di segnale. Al termine dell'allungamento, utilizzare il piezo per accorciare la miofibrile alla lunghezza del margine di flessibilità.

Quindi premere pausa e arresto e salvare i dati. Qui, vengono mostrate tracce di forza di un esperimento di forza attiva con una miofibrile isolata dal muscolo quadricipite umano sano. La miofibrillazione è stata attivata cinque volte con soluzioni con concentrazioni di calcio variabili, con una forza massima media di tutte le miofibrille di circa 123 millinewton per millimetro quadrato.

La costruzione di una curva di concentrazione di calcio di forza dalle forze dell'altopiano raggiunte durante ogni attivazione in ciascuna delle cinque curve di calcio consente il calcolo della concentrazione di calcio al 50% della produzione massima di forza. Come illustrato in questa analisi rappresentativa, le miofibrille possono essere trattate con composti multipli in un singolo esperimento per rispondere a domande aggiuntive sul tipo di miofibrillazione. La forza attiva e la lunghezza del sarcomero possono anche essere misurate per consentire il calcolo dei tassi di riqualificazione, attivazione e rilassamento.

Il forte aumento mostrato nella scatola rossa punteggiata è causato sia dalla viscosità che dall'elasticità. L'altopiano assomiglia solo alla componente elastica. Poiché la viscosità resiste alla deformazione linearmente, la forza è caduta dopo che il ceppo è stato rimosso.

Quando si posiziona il vetro theta, assicurarsi di allinearlo correttamente alla miofibrile. In caso contrario, la soluzione di attivazione potrebbe entrare tra la fibra ottica e il cantilever della sonda di forza e ciò causa la verifica di artefatti nei dati. Inoltre, il miofibrile potrebbe non attivarsi correttamente.

Questo metodo di perfusione è adatto anche per determinare il tipo di fibra muscolare della miofibrile. Ad esempio, è possibile prima perfondere la miofibrile con una normale soluzione di calcio seguita da perfusione della stessa soluzione, ma quindi aggiungere un composto specifico per il miglioramento della forza di tipo fibra muscolare.