Indagine sul metabolismo degli xenobiotici nelle foglie di Alba Salix tramite imaging della spettrometria di massa

Questo metodo utilizza l'imaging della spettrometria di massa (MSI) per comprendere i processi metabolici nelle foglie di S. alba quando esposte agli xenobiotici. Il metodo consente la localizzazione spaziale dei composti di interesse e dei loro metaboliti previsti all'interno di tessuti specifici e intatti.

Questo protocollo consente l'identificazione diretta dei metaboliti previsti in situ. Facilita la determinazione del tipo di tessuti o cellule che sono interessati da uno specifico processo metabolico. Questo metodo è rapido e semplice.

Non richiede una complicata preparazione del campione o l'estrazione dei composti e consente l'identificazione e la localizzazione di composti a bassa abbondanza. Dopo l'acquisizione del campione biologico, raffreddare un portacampione e una lama di criomicrotomo a meno 20 gradi Celsius. Se necessario, versare il terreno di inclusione in uno stampo di plastica posizionato all'interno della camera del crio-microtomo e aggiungere rapidamente il campione al terreno.

Coprire il campione con un ulteriore mezzo di inclusione e regolare la posizione del campione al centro dello stampo secondo necessità man mano che la matrice si solidifica. Quando il campione è pronto, utilizzare il terreno di inclusione per montare il tessuto sul supporto del criomicrotomo e utilizzare la lama raffreddata per tagliare il tessuto in sezioni di dimensioni adeguate, modificando lo spessore e la temperatura di taglio secondo necessità per ottenere campioni ottimali. Man mano che ogni sezione viene acquisita, utilizzare uno strumento appropriato per spostare con cautela la fetta su un vetrino da microscopio rivestito di ossido di indio e stagno e posizionare un dito sotto il vetrino per riscaldare e asciugare il campione prima di posizionare il vetrino nella camera del criomicrotomo.

Quando tutte le fette sono state acquisite, rimuovere lentamente i vetrini dalla camera e utilizzare un pennarello appropriato per indicare la posizione esatta di ciascun campione sui vetrini. Quando tutti i vetrini sono stati contrassegnati, utilizzare uno scanner ad alta risoluzione per scansionare i campioni. Dopo la scansione, pulire il robot per la deposizione della matrice con metanolo al 100% e utilizzare metanolo e un panno di precisione per pulire ogni vetrino, tenendo i campioni senza toccarli e senza rimuovere i segni.

Posizionare un vetrino coprioggetti pulito su ogni vetrino in un'area senza campione e posizionare l'estremità del vetrino coprioggetti del primo vetrino sopra il rivelatore ottico, quindi posizionare non più di sei millilitri di soluzione di matrice appena preparata nel serbatoio di deposizione della matrice e aggiungere due millilitri di metanolo al 100% a un volume totale di otto millilitri. Per la configurazione dell'acquisizione dei dati, posizionare un microlitro di matrice su una piastra MALDI e inserire la piastra nella sorgente. Fare clic su load target nel software del dispositivo e fare clic sul punto nell'immagine che rappresenta la piastra MALDI per selezionare la posizione del punto della matrice.

Indicare il nome e la cartella del campione nella scheda delle informazioni sul campione. Fare clic su acquisizione per avviare l'acquisizione e utilizzare il puntatore del mouse per spostare leggermente la piastra in modo che il laser punti in punti diversi. Al termine dell'acquisizione, aprire la scheda di calibrazione e selezionare l'elenco di calibrazione HCCA in modalità quadratica e fare clic su automatico.

Il risultato della calibrazione globale verrà indicato nella finestra del grafico di calibrazione. Se la calibrazione è nell'intervallo appropriato, fare clic su accetta e salvare il metodo. Una volta terminata la deposizione della matrice sui campioni, posizionare i vetrini nell'adattatore per vetrini e utilizzare una copertura di plastica per recuperare la posizione dei segni.

Nel software di imaging, impostare una nuova esecuzione di imaging nella prima finestra che si apre nel software e assegnare un nome all'esecuzione di imaging. Selezionare la directory dei risultati e fare clic su Avanti. Indicare la dimensione del raster, selezionare il metodo da utilizzare e fare clic su Avanti.

Caricare l'immagine ottica da un vetrino scansionato e fare clic su Avanti. L'immagine si aprirà in una finestra più ampia e posizionerà il coperchio di plastica recante i segni su una lastra MALDI per recuperarne la posizione e facilitare l'insegnamento. Sotto il controllo FTMS, posizionare il bersaglio della finestra video MALDI sulla posizione esatta di un segno e aprire l'imaging flessibile, quindi fare clic sullo stesso punto esatto dell'immagine ottica.

Utilizzare gli strumenti Aggiungi regioni di misurazione per disegnare le regioni di interesse nei campioni e salvare l'esecuzione dell'imaging. Se è necessario analizzare più campioni, eseguire la sequenza di esecuzione automatica e utilizzare il batch runner di esecuzione automatica per avviare una sequenza. Quando tutte le immagini sono state acquisite, utilizzare lo strumento di importazione batch per selezionare i dati grezzi, indicare la directory di destinazione e fare clic su Importa.

Fare clic su file e nuovo per selezionare lo strumento del set di dati per selezionare il tipo di strumento utilizzato per l'acquisizione e fare clic su più per aggiungere il set di dati importato. Fare clic e trascinare per disporre le immagini e controllare e modificare le impostazioni dell'intervallo di massa secondo necessità. Fare clic su Avanti per visualizzare il riepilogo dell'importazione e avviare l'importazione.

Visualizzate il rapporto di carica master in diversi tessuti all'interno di un campione o tra diversi campioni e fate clic sugli spettri per selezionare i rapporti massa-carica di interesse. Esporta i rapporti massa/carica di interesse come file CSV dalla scheda dell'oggetto e fai clic su Esporta. Crea un nuovo set di dati in un programma software di annotazione e fai clic su progetti e importa progetto CSV per importare il file CSV nel software.

Annota con elenchi di analiti personalizzati, che possono essere derivati da database disponibili pubblicamente. Il software fornisce un modello per creare elenchi di analiti. Utilizzare il software di previsione per eseguire la previsione in silico dei metaboliti dei composti annotati.

Recupera l'elenco dei metaboliti, crea un elenco di analiti e utilizza l'elenco nel software di annotazione per annotare i dati grezzi con i metaboliti previsti, quindi fai clic con il pulsante destro del mouse sul metabolita previsto di interesse per recuperare i nomi degli enzimi coinvolti nei processi metabolici nel software di previsione. In questo esempio, è stato determinato che il farmaco Telmisartan è stato distribuito in tutti i campioni di tessuto fogliare della pianta. I metaboliti del farmaco sono stati previsti e ricercati nei dati grezzi e le annotazioni hanno rivelato che un metabolita di prima generazione è stato rilevato nei tessuti interni delle foglie e ulteriormente degradato in metaboliti di seconda generazione localizzati nei tessuti interni o più generalmente distribuiti in tutti i tessuti fogliari.

Questi risultati suggeriscono una reazione metabolica attiva nelle foglie per degradare Telmisartan. Il processo è stato poi applicato a diversi composti di interesse annotati nelle foglie e gli enzimi coinvolti nelle reazioni sono stati recuperati per studiare il loro ruolo nella risposta della pianta all'accumulo di xenobiotici. Sebbene questa procedura sia abbastanza semplice, una buona preparazione del campione è fondamentale.

Assicurati di dedicare del tempo a trovare i parametri che si adattano al tuo tipo di campione durante il sezionamento dei tessuti. La dimensione del campione può essere ulteriormente utilizzata per le osservazioni al microscopio. Può essere colorato per ottenere un pannello di osservazioni biologiche complementari.