LC-MS Analisi delle piastrine umane come una piattaforma per lo Studio del metabolismo mitocondriale

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare in che modo un trattamento xenobiotico o uno stato patologico alterano il metabolismo cellulare. Questo metodo ha il potenziale per rivelare come uno stato patologico o una tossina applicata influenzi il metabolismo cellulare. E una volta che questo è noto, il nostro metodo ha la capacità di rivelare se un qualche tipo di intervento può correggere il difetto.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che non si basa su linee cellulari trasformate, quindi è più probabile che fornisca risposte direttamente rilevanti per la salute umana. Per iniziare questa procedura preparare una soluzione madre da 10 millimolari di rotenone in dimetilsolfossido. Eseguire una diluizione seriale della soluzione madre di rotenone da 10 millimolari per ottenere soluzioni con concentrazioni di rotenone che vanno da un nanomolare a 100 micromolari.

Successivamente, aggiungere 50 microlitri di ciascuna soluzione madre a cinque millilitri di una soluzione tampone arricchita di Tyrode precedentemente preparata per preparare soluzioni con concentrazioni di rotenone comprese tra 10 picomolari e un micromolare. Aggiungere 50 microlitri di DMSO a uno dei campioni di soluzione tampone per fungere da controllo del veicolo. Per isolare le piastrine dal sangue intero, centrifugare campioni di sangue intero a 175 x g per 15 minuti senza interruzioni.

Al termine, trasferire un millilitro dello strato superiore di plasma ricco di piastrine in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quando si trasferisce il plasma ricco di piastrine, fare attenzione a non disturbare il buffy coat in modo che il pellet piastrinico non sia contaminato dai linfociti. Centrifugare lo strato di plasma ricco di piastrine a 400 x g per cinque minuti.

Quindi, aspirare il supernatente. Utilizzando non meno di tre repliche biologiche per ogni condizione, risospendere il pellet piastrinico in un millilitro di ciascuna soluzione di rotenone precedentemente preparata. Successivamente, incubare le piastrine risospese in un incubatore di anidride carbonica con camicia d'acqua impostato al 95% di umidità e al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per un'ora.

A questo punto, pellettare le piastrine centrifugando i campioni a 3000 x g per tre minuti. Dopo aver aspirato il supernatente, aggiungere l'appropriato standard interno marcato con isotopi stabili. Quindi, risospendere le piastrine in 750 microlitri di acido tricloroacetico ghiacciato al 10%.

Sonicare a impulsi ogni campione 30 volte con impulsi di 0,5 secondi. Dopo la centrifugazione, fissare le colonne di estrazione in fase solida C18 a un collettore a vuoto. Condizionare le colonne con un millilitro di metanolo.

Quindi, equilibrare le colonne con un millilitro di acqua bidistillata. Eseguire il surnatante derivato dal campione attraverso le colonne. Al termine, lavare le colonne con un millilitro d'acqua.

Quindi, caricare provette da centrifuga in vetro da 10 millilitri nel collettore del vuoto per raccogliere le frazioni di eluizione. Eluire le colonne con un millilitro di acetato di ammonio 25 millimolare e metanolo. Dopo aver essiccato l'eluato sotto azoto gassoso, risospendere i residui essiccati in 50 microlitri di acido 5%5-solfosaliciclico e trasferire i campioni in file HPLC per l'analisi.

Come precedentemente riportato nelle cellule SH-SY5Y, si ipotizza che i cambiamenti nei livelli relativi di tioesteri di aceil CoA in risposta al rotenone derivino dall'inibizione del complesso uno. In particolare, vi è una diminuzione dose-dipendente del succinile CoA con un aumento simultaneo del beta-idrossibutirril-CoA, mentre i livelli di acetil CoA sono rimasti invariati. L'analisi delle piastrine umane trattate con rotenone rivela risultati altamente coerenti e fornisce un insieme unico di dati sperimentali.

È importante notare che questa osservazione sottolinea la dipendenza mitocondriale della risposta al rotenone perché le piastrine mancano di nuclei. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il tracciamento metabolico per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio: in che modo questo trattamento o lo stato di malattia influisce sull'utilizzo del substrato? Se identifichiamo cambiamenti nei livelli di qualche metabolita, perché sta cambiando?

Quali passaggi del percorso sono interessati e in che modo? Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le piastrine dal sangue intero, eseguire la sfida controllata ex-vivo ed estrarre i tioesteri aceil CoA per l'analisi LCMS.