Guida all'elaborazione di sezioni, coring e immagini per l'approvvigionamento e l'analisi di campioni ossei corticali ad alta produttività per synchrotron Micro-CT

I dati disponibili relativi all'approvvigionamento di campioni ossei per la microtomografia computerizzata di sincrotrone rimangono scarsi. Il nostro tutorial completo fornisce una metodologia semplice, minimamente distruttiva ed economica. L'approvvigionamento di campioni ossei con dimensioni costanti e una forma cilindrica è fondamentale per garantire che i set di dati risultanti siano della massima qualità e che i risultati siano applicabili.

Le tecniche descritte in questo manoscritto sono applicabili al carotaggio di rocce, fossili o qualsiasi materiale duro. Li abbiamo usati per raccogliere nuclei di rocce di dimensioni uniformi e singoli cristalli per esperimenti ad alta pressione per esplorare la reologia della crosta terrestre e del mantello superiore. I carotatori alle prime armi possono scoprire che il campione osseo forma forme coniche.

Questo problema può essere risolto lasciando un tempo adeguato e sufficiente per il deflusso della polvere ossea dalla punta del trapano e rallentando la velocità di carotaggio. Mancano testi didattici e video che dimostrino l'approvvigionamento di campioni ossei per la micro-tomografia computerizzata di sincrotrone e l'analisi logica. Il nostro tutorial passo dopo passo sulla preparazione dell'osso aiuta a colmare questa lacuna.

Posizionare un vetrino da microscopio in vetro da 75 x 25 millimetri su piastre calde fino a 140 gradi Celsius e fondere una generosa quantità di resina epossidica termica al centro del vetrino. Premere l'aspetto inferiore del blocco osseo nella resina epossidica termica sul vetrino del microscopio con la lunghezza dell'osso perpendicolare al vetrino. Spostare il campione avanti e indietro per rivestire la parte inferiore dell'osso e garantire un'adesione sicura.

Lasciare riposare il campione montato sulla piastra riscaldante per circa cinque minuti per consentire alla resina epossidica termica di penetrare nei pori e nelle fessure, assicurandosi che la resina epossidica sul vetrino sia priva di bolle. Se sono presenti bolle, spostare il campione avanti e indietro per rimuoverle. Utilizzare una pinza smussata per rimuovere il vetrino con il campione montato dalla piastra calda e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente per circa 10 minuti, quindi rimuovere l'eventuale resina epossidica dal bordo del vetrino con una lama di rasoio per assicurarsi che il mandrino afferri adeguatamente il vetrino.

Fissare il vetrino con il campione aderente a un mandrino per vetrini e montare il mandrino sul braccio girevole di una sega da sezionamento a bassa velocità, posizionandolo in modo che una sezione trasversale dell'osso possa essere tagliata perpendicolarmente alla sua lunghezza. Regolare il braccio girevole per assicurarsi che la lama tocchi e sezion il campione. Aggiungere pesi sul lato opposto del braccio di taglio per contrastare il peso del braccio e aggiungere acqua distillata e fluido da taglio al recipiente del fluido.

Fissare saldamente la lama del wafer diamantato e assicurarsi che il livello del fluido immerga la parte di taglio della lama. Impostare la velocità a 200 giri/min e abbassare lentamente il campione sulla lama. Una volta che la sega inizia il sezionamento, assicurarsi che la lama e il mandrino non oscillino o rimbalzino.

In tal caso, arrestare immediatamente la sega e serrare la lama o il gruppo del braccio del mandrino. Se il mandrino si muove in modo aggressivo su e giù, aggiungere altri contrappesi. La prima sezione spessa è un taglio di scarto che fornirà una superficie ben definita parallela a ogni taglio aggiuntivo.

Dopo il taglio iniziale dello scarto, sollevare il braccio orientabile e spostare il mandrino di cinque millimetri verso la lama utilizzando la manopola di posizionamento. Al termine del sezionamento, posizionare il vetrino con il campione montato su una piastra calda per sciogliere la resina epossidica termica. Monta sezioni ossee di cinque millimetri sul fondo di una latta di alluminio poco profonda utilizzando la tecnica di incollaggio epossidico termico precedentemente descritta.

Posizionare la latta su un tavolo macchina XY del trapano a colonna e serrare a mano i morsetti di fissaggio. Inserire una punta da carotaggio con punta diamantata per gioiellieri con diametro interno di due millimetri nel mandrino del trapano del mulino e regolare il limitatore di profondità per evitare il carotaggio attraverso lo stagno. Allineare l'aspetto anteriore centrale del campione osseo sotto la punta del trapano, evitando il contatto ravvicinato con il periostio e l'ostio o le aree altamente trabecolari.

Riempire la latta con acqua distillata fino a coprire completamente il campione, evitando l'accumulo di calore, la combustione del campione e il danneggiamento della punta del trapano durante il carotaggio. Il trapano a colonna può essere pericoloso se non vengono prese le adeguate misure di sicurezza. Gli operatori devono assicurarsi di indossare occhiali di sicurezza, che gli indumenti larghi siano fissati e che i capelli lunghi siano tirati indietro in modo che non rimangano impigliati nel mandrino.

Per i primi casi di contatto tra la corona e l'osso, applicare una leggera pressione per indossare un anello sulla superficie superiore dell'osso. Ciò impedisce la flessione della punta all'inizio del processo di carotaggio e garantisce il corretto posizionamento della punta. Durante il carotaggio, sollevare la punta del trapano dentro e fuori dal campione mantenendo la punta della punta sotto la superficie dell'acqua.

Fallo ogni pochi secondi per eliminare la polvere ossea intrappolata e assicurarti che i detriti non occludano la punta del trapano. Al termine del carotaggio, il nucleo osseo risultante può incastrarsi nella punta del trapano a gambo cavo. Usa un paio di pinze a punta fine o una piccola chiave a brugola per rimuovere il nucleo dalla punta.

Conservare il campione carotato in una provetta da microcentrifuga etichettata in un luogo fresco e asciutto fino all'imaging. Il metodo descritto di campionamento delle carote si è dimostrato altamente efficace ed efficiente. Di seguito sono riportate figure rappresentative che confrontano il flusso di lavoro di elaborazione delle immagini di un campione carotato e di uno prelevato utilizzando un utensile rotante.

Il campione tagliato con il comune utensile rotante ha mostrato un aumento del numero di canali e lacune e una diminuzione del diametro medio del canale, del volume del canale e della porosità corticale rispetto al campione carotato. Questa tabella mostra i dati di porosità per ogni campione. Sebbene il protocollo di carotaggio riduca gli artefatti osservati nelle scansioni di tomografia al microcomputer di sincrotrone, le cifre cariche di artefatti di qualità inferiore provenienti dagli esperimenti del blocco osseo rettilineo rappresentano un problema sfaccettato.

La successiva elaborazione delle immagini ha confermato il potenziale della tecnica per migliorare la visualizzazione della microarchitettura dell'osso corticale. Ad esempio, sono state osservate differenze di mineralizzazione, una migliore delineazione dei confini osteonali e una visualizzazione coerente dei tessuti molli all'interno dei canali vascolari. Procedere lentamente è la chiave per ottenere campioni cilindrici di dimensioni costanti.

Andare troppo veloce può far sì che i campioni diventino a forma di cono anziché cilindrico. Durante l'approvvigionamento di sezioni spesse per il carotaggio, è possibile raccogliere ulteriori sezioni spesse per la microscopia a campo chiaro o confocale. Ciò consente la visualizzazione della rete canalicolare.