Modelli avanzati di fegato 3D per test di genotossicità in vitro a seguito dell'esposizione a lungo termine ai nanomateriali

Questa procedura è stata stabilita per essere utilizzata per lo sviluppo di colture epatiche 3D avanzate in vitro, che possono fornire una valutazione più fisiologicamente rilevante dei rischi genotossici associati alle esposizioni di nanomateriali sia su regimi acuti che a lungo termine, a dosi ripetute.

Questo modello di Hep G2 fornisce un sistema di test in vitro alternativo pertinente per valutare in modo più affidabile la potenziale induzione di danni fissi al DNA a seguito di esposizione a lungo termine a nanomateriali, con l'obiettivo di ridurre al minimo la necessità di test sugli animali. Il modello di sferoide Hep G2 possiede la capacità di rimanere vitale e funzionale per un periodo di 14 giorni, oltre a sostenere un adeguato livello di proliferazione. Ciò supporta la verifica di una serie di endpoint biochimici e di genotossicità, tra cui il test del micronucleo.

Prima di provare questo protocollo, ti suggerisco di fare alcune prove prima. Prestare attenzione quando si seminano le cellule o si cambiano i terreni, poiché questi richiedono un approccio delicato. Iniziare aggiungendo 100 microlitri di PBS sterile a temperatura ambiente ai pozzetti di una piastra di coltura da 96 pozzetti.

Capovolgere il coperchio della piastra e pipettare con cura 20 gocce da microlitro della sospensione cellulare al centro di ciascuna scanalatura del pozzetto del coperchio. Utilizzare una pipetta multicanale, aggiungendo da due a quattro gocce alla volta, per garantire l'accuratezza del posizionamento. Semina solo quattro steroidi alla volta e assicurati che le punte della pipetta siano tutte allineate prima di iniziare.

L'angolo con cui si tiene il multicanale farà la differenza per il modo in cui si formano gli sferoidi. Assicurati che le gocce siano centrate all'interno delle scanalature dei pozzetti sul coperchio, quindi capovolgi delicatamente il coperchio sopra la piastra in modo che le gocce pendano dai pozzetti con PBS. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per tre giorni prima del trasferimento degli sferoidi sull'agarosio.

Dopo l'incubazione, rimuovere la piastra dall'incubatrice e sollevare con cautela il coperchio dalla piastra, gettare il PBS, picchiettare la piastra per rimuovere eventuali residui di liquido e lasciare asciugare le piastre all'aria per due o tre minuti. Dopo aver sciolto l'agarosio, agitarlo delicatamente per eliminare eventuali bolle e aggiungere 50 microlitri alla base di ogni pozzetto. Lasciare la piastra a temperatura ambiente per due minuti, quindi aggiungere 100 microlitri di DMEM preriscaldato sopra lo strato di agarosio solido in ogni pozzetto.

Riposizionare il coperchio con queste goccioline di sferoidi sopra la piastra in modo che gli sferoidi siano di nuovo appesi, quindi centrifugare la piastra per tre minuti a 200 volte G per trasferire gli sferoidi nei singoli pozzetti della piastra. Incubare la piastra per altre 24 ore per consentire agli sferoidi di depositarsi. Dopo la dispersione dei nanomateriali ingegnerizzati, o ENM, diluirli alla concentrazione finale desiderata con DMEM preriscaldato.

Aspirare 50 microlitri di terreno da ogni pozzetto con gli sferoidi e sostituirlo con 50 microlitri di terreno con l'ENM. Per raccogliere gli sferoidi, utilizzare una pipetta da 200 microlitri per aspirare i 100 microlitri di terreno di coltura cellulare con il tessuto sferoidale da ciascun pozzetto, facendo attenzione a evitare il contatto con l'agarosio. Raccogliere gli sferoidi in una provetta da centrifuga sterile da 15 millilitri.

Centrifugare la sospensione sferoidale a 230 volte G per cinque minuti, quindi rimuovere il surnatante e conservarlo a meno 80 gradi Celsius fino a ulteriori analisi. Lavare il pellet di sferoidi in un millilitro di PBS sterile a temperatura ambiente, quindi centrifugarli a 230 volte G per tre minuti e scartare il surnatante. Risospendere gli sferoidi in 500 microlitri di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,05% e incubarli per sei-otto minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Dopo l'incubazione, pipettare delicatamente le cellule Hep G2 tripsinizzate su e giù per dissociarle completamente e risospenderle prima di neutralizzarle con un millilitro di DMEM. Centrifugare la sospensione cellulare a 230 volte G per cinque minuti, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in due millilitri di PBS. Per creare un imbuto per cuvetta, posizionare il vetrino da microscopio preparato nel supporto metallico, posizionare una scheda filtrante sopra il vetrino, quindi fissare l'imbuto per cuvetta sulla parte superiore.

Disporre gli imbuti della cuvetta nella citocentrifuga con l'imbuto rivolto verso l'alto in modo da poter aggiungere direttamente 100 microlitri di sospensione cellulare in ciascuno di essi. Quindi procedere con il fissaggio dei vetrini secondo le indicazioni del manoscritto. Preparare una soluzione colorante Giemsa al 20% diluita in tampone fosfatasi.

Pipettare delicatamente la soluzione su e giù per mescolarla, quindi filtrarla con carta da filtro piegata in un imbuto. Utilizzare una pipetta Pasteur per aggiungere da tre a cinque gocce di soluzione di Giemsa filtrata al citodot su ciascun vetrino e lasciarlo per otto-10 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini in due lavaggi successivi con tampone fosfatasi.

Quindi sciacquarli brevemente sotto l'acqua fredda per rimuovere eventuali macchie in eccesso e lasciarli asciugare all'aria. Prima di qualsiasi valutazione tossicologica in vitro, è importante verificare che gli sferoidi 3D HepG2 si siano formati correttamente. Quattro giorni dopo la semina, dovrebbero formarsi sferoidi compatti di forma sferica con una superficie liscia e senza proiezioni visive.

Qui vengono dimostrati sferoidi di buona qualità e di scarsa qualità quattro giorni dopo la semina. In genere, dal 90 al 95% degli sferoidi formati per piastra si formeranno correttamente e saranno vitali per ulteriori sperimentazioni. La vitalità e la funzionalità epatica sono state valutate in un periodo di coltura di 14 giorni per determinare la longevità del modello di sferoide epatico e stabilire se potesse supportare l'ENM a lungo termine o la valutazione del rischio su base chimica.

La concentrazione di albumina è rimasta costante per tutta la durata del periodo di coltura, mentre la produzione di urea per sferoide è aumentata prima di iniziare a diminuire al giorno 14. Per la valutazione della genotossicità, il test del micronucleo è stato utilizzato per determinare la presenza di micronuclei a seguito di esposizioni acute e a lungo termine all'ENM. Gli sferoidi sono stati esposti a due ENM, biossido di titanio e argento.

Una tendenza simile per la genotossicità è stata osservata dopo l'esposizione acuta a entrambi gli ENM, ma l'elevata risposta di genotossicità non era evidente dopo un'esposizione a lungo termine di cinque giorni. Seguendo questo metodo, sia il surnatante che gli sferoidi possono essere raccolti per una moltitudine di endpoint biochimici. Questi includono la vitalità cellulare, i saggi di funzionalità epatica, l'analisi SID 450, gli scarsi marcatori infiammatori e l'espressione genica.

Questa tecnica è attualmente in fase di sperimentazione in un certo numero di laboratori di ricerca a contratto che desiderano applicarla ai test di geotossicità di routine sia di sostanze chimiche che di nanomateriali. Ciò ha il potenziale per ridurre la dipendenza dagli approcci di test in vivo.