Name: Test migliorato di fecondità e fertilità per Aedes aegypti utilizzando 24 piastre di coltura dei tessuti dei pozzi (piastre EAgaL) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Scopri un metodo ottimizzato per valutare la fecondità e fertilità di Aedes aegypti utilizzando piastre a 24 pozzi. Questo protocollo riduce tempo e spazio rispetto ai metodi tradizionali.

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Ringraziamo texas A&M Agrilife Research Insect Vectored Diseases Grant Program per il finanziamento. Ringraziamo anche i membri del laboratorio Adelman per l'aiuto nello sviluppo di questo metodo e suggerimenti durante la stesura del manoscritto, così come i membri del laboratorio Kevin Myles. Ringraziamo anche i recensori e gli editori per il loro aiuto nel migliorare questo manoscritto.

1. Preparazione della piastra
<ol><li>Praticare fori in 24 coperchi di piastre di coltura tissutale bene (4−6 fori per pozzo) utilizzando un trapano domestico con un bit ~1,6 mm (1/16 in)(Figura 2). NOTA: Questi fori impediscono la condensa dell'acqua dall'agarosio per accumularsi sul coperchio, dove le zanzare possono deporre le uova. La dimensione standard della femmina Ae. aegypti ("Liverpool" strain) è di ~ 3,11 mm di apertura alare. Si consiglia di ridurre le dimensioni dei fori quando si utilizzano zanzare più piccole per evitare la fuga dalla piastra.</li>
	<li>Il giorno prima dell'esperimento di ovideposizione, lavare e risciacquare accuratamente le piastre e immergerle in candeggina all'1−5% per 30−60 minuti a temperatura ambiente. Risciacquare accuratamente sotto l'acqua deionizzata corrente e asciugarli. NOTA: Questo processo riduce la possibilità che funghi e batteri crescono sull'agarosio.</li>
	<li>Sciogliere l'agarosio al 2% in acqua deionizzata e aggiungere immediatamente 500 μL dell'agarosio fuso ad ogni pozzo delle 24 piastre del pozzo utilizzando una pipetta da 1.000 μL(Figura 3A,B). Quando l'agarosio inizia a raffreddarsi e ostruire la punta della pipetta, surriscaldare l'agarosio e utilizzare una nuova punta di pipetta. NOTA: Evitare di toccare le pareti del pozzo con la punta della pipetta perché può lasciare un pezzo di agarosio sul muro dove una femmina può deporre le uova, complicando il processo di imaging e conteggio.</li>
	<li>Prima dell'uso, asciugare qualsiasi condensa sulle pareti del pozzo durante la notte su un banco da laboratorio(Figura 3C,D). NOTA: La sequenza temporale del saggio della piastra EAgaL dall'alimentazione del sangue all'imaging larvale è raffigurata nella figura 4, che è per le zanzare colonia(Ae. aegypti "Liverpool" allevato sotto 14 h di luce:10 h ciclo di luce scura, 27 °C, 80% umidità relativa, 500 larve in un vassoio di 49,5 cm x 29,2 cm x 9,5 cm con 2 L di acqua), in condizioni insetti. Si raccomanda a ciascun laboratorio di testare la piastra EAgaL con le zanzare utilizzate, specialmente quando si utilizzano ceppi diversi, diverse specie di zanzare e diversi protocolli di allevamento.</li>
</ol>2. Alimentazione delle zanzare
NOTA: È fondamentale utilizzare zanzare allevate in condizioni uniformi per tutti i gruppi di trattamento e gruppi di controllo, perché la nutrizione larvale ha un impatto sui parametri di fitness delle zanzare10,11. Larve posteriori in condizioni poco affollate con cibo sufficiente. Lascia che le zanzare femminili echino in presenza di maschi in modo che l'accoppiamento sia assicurato e maturi per almeno 3 giorni.
<ol><li>Rimuovere qualsiasi fonte di acqua e /o zucchero dalle zanzare femminili almeno 16 ore prima dell'alimentazione del sangue al fine di migliorare l'alimentazione del sangue.</li>
	<li>Riscaldare un circolatore d'acqua per l'alimentazione artificiale a 37 °C e nutrire le zanzare femminili utilizzando sangue vertebrato posto in alimentatori artificiali per 15−30 min(Figura 5A).</li>
	<li>Anestetizzare le zanzare con CO2 o sul ghiaccio, trasferirle in un piatto di vetro sul ghiaccio e selezionarne di ornate di sangue (Figura 5B) in un contenitore dotato di acqua di saccarosio al 30% per più di 72 ore, quando le femmine terminano l'escrezione e lo sviluppo delle uova. NOTA: Se alle femmine viene fornita una concentrazione inferiore di acqua di saccarosio, rimuovere l'acqua di saccarosio e le eventuali superfici umide dopo 48 ore per evitare che le femmine ovipositing.</li>
</ol>3. Ovideposizione
<ol><li>Circa 1 h prima di trasferire le zanzare alle piastre, aggiungere 2−3 gocce (~80−120 μL) di acqua in ogni piastra bene usando una pipetta di trasferimento.</li>
	<li>Almeno 72 ore dopo l'alimentazione del sangue, abbattere le zanzare con CO2 o sul ghiaccio, trasferirle in un piatto di vetro sul ghiaccio e posizionare individualmente ogni zanzara su un coperchio rovesciato del piatto di 24 pozzetti sul ghiaccio(Figura 6A). NOTA: Questa procedura è stata applicata da Ioshino etal.</li>
	<li>Una volta posizionate tutte le 24 zanzare, coprire il coperchio con un fondo piastra rovesciato(Figura 6B),fissare il coperchio e la piastra con un nuovo elastico fresco e posizionare in una camera ambientale (o in una stanza di allevamento)(Figura 6C)fino a quando le zanzare non si riprendono (~ 10−15 min) e ruotano il lato destro della piastra verso l'alto(Figura 6D).</li>
	<li>Lasciare che le zanzare femminili ovoposi per 24−48 h e rimuovere le femmine rilasciandole dai piatti in una grande gabbia. NOTA: Se è importante tenere traccia delle singole femmine, anestetizzarle raffrezzandole e rimuoverle singolarmente sul ghiaccio. L'ovideposizione ritardata e le escrezioni scure che interferiscono con il conteggio delle uova sono state osservate quando le femmine sono state trasferite nelle piastre prima di 72 ore dopo la farina di sangue (PBM) (Figura 7D).</li>
</ol>4. Conteggio delle uova
<ol><li>Controlla ogni pozzo della piastra del pozzo 24, poiché a volte le zanzare depongono le uova sulla parete dei pozzi e a margine della superficie agarosio / plastica, dove sono difficili da risolvere nelle fotografie. Usando un pennello bagnato, spostare le uova deposte sul muro e sul bordo dell'agarosio sulla superficie piatta dell'agarosio in modo che tutte le uova si trovano su un piano uniforme e non si sovrappongano tra loro. NOTA: Il bordo dell'agarosio è in genere fuori dal piano focale della fotocamera a causa della tensione superficiale della soluzione di agarosio.</li>
	<li>Utilizzando le forcep, rimuovere eventuali gambe rotte, ali e altre particelle nei pozzi che possono interferire con l'imaging delle uova (Figura 7C).</li>
	<li>Inserire carta bianca sotto la piastra per aumentare il contrasto con le uova di zanzara scure prima dell'imaging utilizzando un illuminatore stereomicroscopico (Figura 7A).</li>
	<li>Scatta un'immagine di ogni pozzo utilizzando una fotocamera digitale compatta in modalità microscopio, che consente all'utente di concentrarsi su oggetti fino a 1 cm. Questa capacità consente di posizionare la fotocamera direttamente sulla piastra per immagini le uova senza treppiede o supporto (Figura 7A). Per distinguere le singole uova deposte in ciuffi, utilizzare la modalità fine o super fine per catturare immagini ad alta risoluzione in modo da poter visualizzare i dettagli ravvicinati. NOTA: cancellare la scheda di memoria della fotocamera prima dell'uso per evitare confusione tra immagini nuove e vecchie.</li>
	<li>Dopo aver fotografato ogni pozzo di una lastra, scattare un'immagine dell'intera lastra con un'etichetta dell'ordine di imaging per distinguere ogni lastra in un secondo momento (Figura 7E).</li>
	<li>Aggiungere uno strato sottile ~ 5 gocce d'acqua (~ 200 μL) con una pipetta di trasferimento ad ogni pozzo per evitare che il suo tappo di agarosio e le uova si asciughino e per indurre lo sviluppo e la schiusa dell'embrione. Prestare attenzione ai livelli dell'acqua per le prime ore e controllare ogni giorno, perché potrebbe esserci perdita d'acqua dovuta all'assorbimento da parte dell'agarosio o all'evaporazione. Aggiungere acqua quando il suo livello è troppo basso per far schiudere le larve. NOTA: L'evaporazione dell'acqua avviene in modo non uniforme sia all'interno di una piastra che all'interno di una pila di piastre. È stato osservato che l'essiccazione avviene nel seguente ordine: 1) i pozzi d'angolo (A1, A6, D1, D6) si asciugano più velocemente; seguito da 2) pozzi sul bordo esterno della piastra (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); e ultimi 3) pozzi all'interno. Quando le piastre sono impilate, la piastra superiore si asciuga più velocemente.</li>
	<li>Trasferire le immagini in un computer con ImageJ (Fiji) e rinominare i file per un'organizzazione più semplice, ad esempio "[ID piastra]_[ID pozzo].jpg" (Figura 8A,B).</li>
	<li>Creare un file di foglio di calcolo per registrare i numeri delle uova (ad esempio, fecondità) e i numeri larvali e calcolare la velocità di tratteggio (cioè la fertilità)(Figura 9E).</li>
	<li>Aprite le immagini con ImageJ (Fiji)12 e usate lo strumento "multi-punto" per contrassegnare ogni uovo (Figura 9A−C); zoom-in o zoom-out usando "+" o "–" tasto per contare le uova in ciuffi. Dopo aver segnato tutte le uova, fare doppio clic sull'icona a più punti per riportare il numero di segni (Figura 9D). Registrare i risultati in un foglio di calcolo.</li>
</ol>5. Valutazione della fertilità
NOTA: In 2 giorni, le prime larve instar possono iniziare a precludersi nei pozzi. Attendere altri 3−5 giorni prima dell'imaging/conteggio per assicurarsi che tutte le uova vitali si schiudano.
<ol><li>Preparare il cibo larvale mescolando 1/16 cucchiaio (~168 mg) di cibo macinato per pesci (cioè una normale dieta larvale di zanzara) in 20 mL di acqua e in attesa che si stabiliscino grandi particelle solide(Figura 10A−D). Inizia ad aggiungere cibo (il supernatante) ai pozzi che contengono larve tratteggiate non appena appaiono, perché non sopravvivono a lungo senza cibo. NOTA: L'aggiunta eccessiva di particelle alimentari può interferire con l'imaging e il conteggio delle larve tratteggiate.</li>
	<li>Circa 5-8 giorni dopo l'aggiunta di acqua ai pozzi, raffreddare il piatto coprendo con ghiaccio schiacciato per 15−20 minuti per anestetizzare le larve.</li>
	<li>Scatta immagini di ogni pozzo mantenendo i piatti sul ghiaccio come è stato fatto con le uova. Per le immagini larvali, fornire uno sfondo scuro inserendo un materiale nero sotto la piastra per aiutare a migliorare il contrasto. Dopo aver fotografato ogni pozzo di una piastra, scatta un'immagine dell'intera piastra con un'etichetta dell'ordine di imaging per distinguere ogni lastra in seguito. NOTA: Le immagini vengono scattate mentre le piastre sono sul ghiaccio perché il movimento larvale può compromettere il conteggio. Le piastre sono riutilizzabili; congelare e rimuovere le zanzare e l'agarosio per pulire per il prossimo utilizzo. La piastra EAgaL non è adatta per allevare larve a stadi avanzati.</li>
	<li>Apri le immagini con ImageJ (Fiji) e usa lo strumento "multi-punto" per contare facendo clic su ogni larva. Nel periodo di 3−5 giorni alcune larve potrebbero essere state fuse, specialmente nei pozzi con un basso numero di larve. Pertanto, durante il conteggio, escludere le cuticole del capannone (cioè le exuviae), che sembrano larve solo per la testa con un po 'di corpo, o larve rimpicciolite(Figura 10E). Registrare i risultati nel foglio di calcolo.</li>
</ol>6. Eseguire analisi
<ol><li>Dopo aver raccolto tutti i dati necessari per l'analisi della fecondità e della fertilità, eseguire analisi statistiche appropriate e creare grafici utilizzando il software preferito.</li>
</ol>

<ol><li>Bond, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+irradiation+dose+to+Aedes+aegypti+and+Ae.+albopictus+in+a+sterile+insect+technique+program%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program.</a> PLoS One. 14 (2), 0212520(2019).</li>
<li>Fernandes, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+larvae+treated+with+spinosad+produce+adults+with+damaged+midgut+and+reduced+fecundity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity.</a> Chemosphere. 221, 464-470 (2019).</li>
<li>Inocente, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insecticidal+and+Antifeedant+Activities+of+Malagasy+Medicinal+Plant+%28Cinnamosma+sp.%29+Extracts+and+Drimane-Type+Sesquiterpenes+against+Aedes+aegypti+Mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes.</a> Insects. 10 (11), 373(2019).</li>
<li>Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+transgenesis%3A+what+is+the+fitness+cost%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Mosquito transgenesis: what is the fitness cost.</a> Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).</li>
<li>da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+blood-free+diet+for+Anopheles+darlingi+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. , 217(2019).</li>
<li>Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+serum+and+BSA%2C+but+neither+red+blood+cells+nor+hemoglobin+can+support+vitellogenesis+and+egg+production+in+the+dengue+vector+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti.</a> PeerJ. 3, 938(2015).</li>
<li>Gonzales, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+SkitoSnack%2C+an+Artificial+Blood+Meal+Replacement%2C+on+Aedes+aegypti+Life+History+Traits+and+Gut+Microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota.</a> Scientific Reports. 8 (1), 11023(2018).</li>
<li>Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Candidate+Iron+Transporters+From+the+ZIP%2FZnT+Gene+Families+in+the+Mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti.</a> Frontiers in Physiology. 9, 380(2018).</li>
<li>Ioshino, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oviplate%3A+A+Convenient+and+Space-Saving+Method+to+Perform+Individual+Oviposition+Assays+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti.</a> Insects. 9 (3), 103(2018).</li>
<li>Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+mosquitoes%2C+large+implications%3A+crowding+and+starvation+affects+gene+expression+and+nutrient+accumulation+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti.</a> Parasites & Vectors. 8, 252(2015).</li>
<li>Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+vector+arthropod+culture%3A+an+example+using+the+African+malaria+mosquito%2C+Anopheles+gambiae+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae).</a> Malaria Journal. 15 (1), 262(2016).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse per questo studio.

La piastra EAgaL riduce drasticamente il lavoro, il tempo e lo spazio per condurre test individuali di fecondità e fertilità in Aedes aegypti rispetto al metodo FT. Il confronto preliminare tra il metodo FT e la piastra EAgaL ha comportato tempi più brevi per tutte le fasi (la tecnica di imaging è stata applicata al metodo FT)(tabella 1). Come riferimento, nella tabella 2 sono fornite una stima dei costi di avviamento e di dosaggio (una piastra EAgaL da 24 pozzi contro 24 TT).</...

Il controllo delle zanzare per proteggere gli esseri umani da agenti patogeni trasmesse da vettori è un importante obiettivo di salute pubblica, principalmente a causa della mancanza di vaccini efficaci per la maggior parte degli agenti patogeni trasportati dalle zanzare. Molti studi mirano a ridurre la forma fisica delle zanzare in combinazione con una strategia di riduzione della popolazioneapplicabile sul campo 1,2,3. Ciò include studi approfonditi per creare zanzare transgeniche e / o linee knockout CRISPR / Cas9. Tali approcci di modifica della popolazione richiedono una valutazione dettagliata dei singoli parametri di idoneità4. Le tecniche di laboratorio convenzionali per valutare l'idoneità delle zanzare femminili includono il contenimento individuale di zanzare femminili accoppiate e alimentate a sangue in contenitori da 100 ml5,tubi conici modificati da 50 ml o tubi per l'allevamento di Drosophila modificati fornendo superfici umide utilizzando cotone umido e dischi di carta filtrante per l'ovideposizione (cioè carte d'uovo)1,2,6,7. Tali metodi richiedono uno spazio relativamente grande (ad esempio, 30 cm x 30 cm x 10 cm: W x L x H per un massimo di 100 tubi Drosophila) (Figura 1),e la manipolazione di singole carte uovo per il conteggio di uova e larve da cova, che possono essere laboriose. Questo manoscritto presenta un metodo per contare le uova di zanzara e determinare i tassi di schiusa utilizzando 24 piastre di pozzo e agarosio come superficie di ovideposizione peraggirare questi problemi 8.
Contemporaneamente, Ioshino etal. Il loro protocollo rappresentava un miglioramento significativo rispetto ai metodi convenzionali nel risparmiare tempo espazio 9. Tuttavia, il protocollo che hanno descritto continua a utilizzare carta filtrante bagnata come superficie per l'ovideposizione, che richiede lo spiegamento di ogni singola carta per ottenere conteggi, poiché le uova si trovano spesso sotto o in pieghe. Il loro protocollo inoltre non includeva l'uso di tecnologie di imaging o un metodo per il conteggio larvale.
Presentato è un metodo migliorato per eseguire test di fitness per il numero di uova (cioè fecondità) e il tasso di schiusa (cioè la fertilità) usando l'agarosio come superficie di ovideposizione in un formato di piastra di coltura tissutale di 24 po 'per Ae. aegypti che oviposit su superfici umidi. Queste tavole sono state chiamate piatti "EAgaL", da Egg, Agarose e Larva. Questi 24 piastre di pozzo forniscono alle singole zanzare una superficie minima per deporre le uova, semplificando e riducendo drasticamente il tempo e lo sforzo necessari per contare e mantenere le uova e le larve tratteggiate per alcuni giorni. La piastra EAgaL utilizza agarosio traslucido per la superficie di ovideposizione, che elimina la necessità di maneggiare le carte uovo e trovare le uova e le larve quando schiuse; fotografare ogni pozzo stabilisce una registrazione archiviata a lungo termine dei risultati e separa il processo di conteggio sia nel tempo che nello spazio dal processo di allevamento / movimentazione, dove il tempo è spesso limitato.

<table><tbody><tr><td>1,6 mm &Phi; punta</td><td></td><td></td><td>da trapano in alternativa chiodi riscaldati possono essere utilizzati</td></tr><tr><td>1000 &mu; Puntali per pipette L (lunghi)</td><td>Olympus plastics</td><td>24-165RL</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti</td><td>Thermo Scientific</td><td>930186</td><td>trasparente, a fondo piatto con piastre con coperchio ad anello</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>VWR</td><td>0710-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera digitale compatta</td><td>Computer Olympus</td><td>TG-5/TG-6</td><td></td></tr><tr><td>(Windows, Mac o Linux)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acqua deionizzata</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji (imageJ) software</td><td></td><td></td><td>scaricare da: https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td>Pinze</td><td>Dumont</td><td></td><td>pinze affilate possono rompere il corpo della zanzara</td></tr><tr><td>Piastre di Petri in vetro</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Candeggina</td><td></td><td></td><td></td>per uso domestico</tr><tr><td>Trapano elettrico</td><td></td><td></td><td></td>per uso domestico</tr><tr><td>illuminatore per stereomicroscopio (collo d'oca)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta P-1000</td><td>Pennelli</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> Gilson <tr><td>Elastici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scheda</td><td></td><td></td> SD <td>per registrare immagini di fotocamere digitali (DSHC, SDXC dovrebbe essere migliore)</td></tr><tr><td>Software per fogli di calcolo (Microsoft Excel)</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Qualsiasi software per fogli di calcolo funziona</td></tr><tr><td>TetraMin cibo per pesci</td><td>Tetra</td><td></td><td>macinato con macinacaffè, frullatore o mortaio e pestello</td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento</td><td>VWR</td><td>16011-188</td><td></td></tr></tbody></table>

test migliorato di fecondità e fertilità per aedes aegypti utilizzando 24 piastre di coltura dei tessuti dei pozzi (piastre eagal)

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Le zanzare rappresentano un problema significativo di salute pubblica come vettori di vari agenti patogeni. Per quegli studi che richiedono una valutazione dei parametri di fitness delle zanzare, in particolare la produzione di uova e i tassi di schiusa a livello individuale, i metodi convenzionali hanno gravato in modo sostanziale sugli investigatori a causa dell'elevata intensità di lavoro e dei requisiti di spazio di laboratorio. Descritto è un metodo semplice che utilizza 24 piastre di coltura tissutale del pozzo con agarosio in ogni pozzo e imaging digitale di ogni pozzo per determinare il numero di uova e i tassi di schiusa a livello individuale con requisiti di tempo e spazio sostanzialmente ridotti.

Le zanzare sono state iniettate con dsRNA che prende di mira un trasportatore di ferro candidato (FeT) o un gene di controllo (EGFP), alimentato dal sangue e misurato per la fecondità e la produzione di fertilità utilizzando il metodo della piastra EAgaL, seguendo la procedura sopra descritta.
Le zanzare in cui l'espressione fet è stata silenziata a seguito dell'iniezione di dsRNA hanno mostrato una significativa riduzione sia del numero di uova che del tasso di schiusa (F...

Descritto è un metodo di risparmio di tempo e spazio per contare le uova e determinare i tassi di schiusa delle singole zanzare utilizzando 24 piastre di coltura tissutale del pozzo, che possono aumentare sostanzialmente la scala e la velocità dei test di fecondità e fertilità.

Test migliorato di fecondità e fertilità per Aedes aegypti utilizzando 24 piastre di coltura dei tessuti dei pozzi (piastre EAgaL)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...

Questa procedura consente ai ricercatori di zanzare di affrontare facilmente la forma fisica riproduttiva delle loro zanzare a livello individuale. Rispetto ai metodi convenzionali, questo protocollo riduce significativamente il tempo, lo spazio e il lavoro necessari per testare la fecondità e la fertilità delle zanzare a livello individuale. Inizia preparando le lastre per l'esperimento di ovideposizione.Praticare da quattro a sei fori per pozzo nel coperchio di una piastra di coltura da 24 pozzetto utilizzando un trapano domestico con un bit di 1,6 millimetri. Un giorno prima dell'esperimento, lavare e risciacquare i piatti e immergerli in candeggina dall'1% al 5% per 30-60 minuti a temperatura ambiente. Quindi, sciacquare accuratamente le piastre sotto l'acqua deionizzata corrente e asciugarle.Sciogliere il 2% di agarosio in acqua deionizzata e aggiungere immediatamente 500 microlitri dell'agarosio fuso a ciascun pozzo di una piastra di 24 pozzi. Lasciare le piastre sulla panchina del laboratorio durante la notte per asciugare qualsiasi condensa. Almeno 16 ore prima dell'alimentazione del sangue, rimuovere qualsiasi fonte di acqua o zucchero dalle zanzare femminili.Il giorno del

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Le zanzare Aedes aegypti infettate con Wolbachia vengono rilasciate in popolazioni naturali di sopprimere la trasmissione dell'arbovirus. Descriviamo i metodi retro Ae. aegypti con Wolbachia infezioni in laboratorio per esperimenti e rilascio di campo, prendendo precauzioni per ridurre al minimo la selezione e l'adattamento di laboratorio.

Mantenimento di Aedes aegypti zanzare infettate con Wolbachia

Un protocollo per la coltura del parassita microsporidiano Edhazardia aedis. Il parassita viene trasferito da una generazione di zanzare Aedes aegypti all'altra tramite trasferimento orizzontale nella fase larvale seguita da trasmissione verticale nella fase adulta. Gli sporoplasmi vivi sopravvivono a lungo termine nelle uova infette.

Propagazione del parassita microsporidiano Edhazardia aedis nelle zanzare Aedes aegypti

La tecnica degli insetti sterili (SIT) viene utilizzata per controllare specifiche popolazioni di zanzare importanti dal punto di vista medico che possono essere resistenti ai controlli chimici. Qui, descriviamo un metodo di allevamento di massa e preparazione di zanzare maschi sterili per il rilascio in un programma SIT operativo mirato alla zanzara Aedes aegypti .

Preparazione di zanzare Aedes aegypti maschi irradiate e marcate per il rilascio in un programma operativo di tecnica degli insetti sterili

I microbi intestinali possono avere un impatto positivo o negativo sulla salute del loro ospite attraverso meccanismi specifici o conservati. Caenorhabditis elegans è una comoda piattaforma per lo screening di tali microbi. Il presente protocollo descrive lo screening ad alto rendimento di 48 isolati batterici per l'impatto sulla resistenza allo stress dei nematodi, utilizzati come proxy per la salute dei vermi.

Screening ad alta produttività di isolati microbici con impatto sulla salute di Caenorhabditis elegans

Qui, presentiamo un metodo generale per determinare la vitalità embrionale e il numero totale di embrioni prodotti (covata) utilizzando l'organismo modello C. elegans.

Misurazione della vitalità embrionale e delle dimensioni della covata in Caenorhabditis elegans

Il presente protocollo descrive come misurare i dati dei parametri di vita comuni nelle zanzare Aedes aegypti , tra cui fecondità, dimensioni delle ali, fertilità, rapporto tra i sessi, vitalità, tempi di sviluppo, contributo maschile e longevità adulta. Queste misurazioni possono essere utilizzate per valutare l'idoneità delle zanzare transgeniche.

Quantificazione dei costi di fitness nelle zanzare transgeniche Aedes aegypti

Scopri un metodo ottimizzato per valutare la fecondità e fertilità di Aedes aegypti utilizzando piastre a 24 pozzi. Questo protocollo riduce tempo e spazio rispetto ai metodi tradizionali.

Test migliorato di fecondità e fertilità per Aedes aegypti utilizzando 24 piastre di coltura dei tessuti dei pozzi (piastre EAgaL) (Video) | JoVE Journal

Test migliorato di fecondità e fertilità per Aedes aegypti utilizzando 24 piastre di coltura dei tessuti dei pozzi (piastre EAgaL)

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