Name: Analisi del fenotipo scheletrico di un modello di mouse di eliminazione Stat3 condizionale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Scopri l'analisi del fenotipo scheletrico in modelli murini con delezione condizionale di Stat3 utilizzando tecniche istologiche, TRAP staining e micro CT. Questo metodo aiuta a studiare la differenziazione degli osteoclasti e la regolazione della massa ossea.

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Ringraziamo il Prof. Weiguo Zou e S. Kato per reagenti e topi e i membri del laboratorio Zou per utili discussioni. Ringraziamo anche il Laboratorio per la Stomatologia Digitalizzata e il Centro di Ricerca per le Anomalie Craniofacciali del Nono Ospedale Popolare di Shanghai per l'assistenza. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit & Plateau Disciplines, il fondo SHIPM-mu dello Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], il Progetto incentive del team di innovazione di alto livello per la Shanghai Jiao Tong University School of Medicine , il Fondo di ricerca interdisciplinare del nono ospedale popolare di Shanghai, Shanghai JiaoTong University School of Medicine [JYJC201902]. E L.J. è uno studioso dell'Outstanding Youth Medical Talents, del programma di sviluppo giovanile "Rising Stars of Medical Talent" di Shanghai e del progetto "Chen Xing" della Shanghai Jiaotong University.

Tutti i metodi relativi agli animali qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Shanghai Jiaotong University School of Medicine.
1. Allevamento di topi di cancellazione Stat3 specifici dell'osteoclasta
NOTA: I topi Stat3fl/fl sono stati ottenuti commercialmente. I topi Ctsk-Cre sono stati forniti da S. Kato (Università di Tokyo, Tokyo, Giappone12). I topi sono stati allevati e mantenuti in specifiche condizioni esenti da agenti patogeni (SPF) nell'impianto istituzionale di origine animale in condizioni standardizzate.
<ol><li>Abbina un topo maschio sessualmente maturo a due topi femmine della stessa età. Dopo 18 giorni, controlla i controlli giornalieri per i neonati. Separare i topi femmine gravidi e tenerlo solo se necessario. Cambia topi maschi tra diverse gabbie di riproduzione se i topi femmine non erano incinte entro 1 mese dall'accoppiamento.</li>
	<li>Incrocia itopi fl/fl Stat3 con i topi Ctsk-Cre (F0). Agganciare le code per la genotipizzazione e mantenere il maschio Stat3fl/+; Topi Ctsk-Cre fino a quando non sono sessualmente maturi, che ha circa 6 settimane di età (F1). Utilizzare i seguenti primer: Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTTCGTTC.</li>
	<li>Croce maschio di 6 settimane Stat3fl/+; Topi Ctsk-Cre con topi Stat3fl/fl femminili. Ritagliare le code per il genotipizzazione e mantenere il maschio Stat3 fl/fl; Topi Ctsk-Cre fino a quando non sono sessualmente maturi, che ha circa 6 settimane di età (F2).</li>
	<li>Attraversa stat3 fl/fl maschio di 6 settimane; Topi Ctsk-Cre con topi Stat3fl/fl femminili (F3). Ritagliare le code per il genotipizzazione e sostituire i vecchi topi riproduttori con topi più giovani nel tempo (F3 +N).</li>
</ol>2. Raccolta campioni
<ol><li>Eutanasia sei paia di topi maschi Stat3fl/fl e Stat3Ctsk di 8 settimane separatamente con asfissia di anidride carbonica. NOTA: La portata di CO2 sposta il 30% del volume della gabbia al minuto (ad esempio, per 45 cm x 30 cm x 30 cm di gabbia la portata di CO2 è di 40 L/min).</li>
	<li>Posizionare i topi in posizione supina. Dislocare delicatamente a mano le articolazioni bilaterali dell'anca. Utilizzare forbici oftalmiche per tagliare la pelle verticalmente dalla tibia distatale e quindi sezionare l'intera pelle dall'arto posteriore.</li>
	<li>Tagliare il legamento articolare dell'articolazione destra dell'anca e dell'articolazione del ginocchio con le forbici per separare l'arto posteriore. Tagliare il trochanter e la giunzione della fibula e quindi immergere l'arto posteriore in paraformaldeide al 4%. Tenere gli arti posteriori giusti per il passaggio 3. Tagliare in modo appropriato l'osso ad entrambe le estremità per immergere completamente e fissare il midollo osseo con paraformaldeide al 4%.</li>
	<li>Tagliare il legamento articolare dell'articolazione sinistra dell'anca e dell'articolazione del ginocchio con le forbici, rimuovere delicatamente il tessuto molle e separare accuratamente la tibia e il femore. Immergere la tibia e il femore separatamente nel 75% di etanolo. Mantenere la femora per il passaggio 4 e tibiae per il passaggio 6. Assicurarsi di mantenere intatto il trochanter.</li>
</ol>3. Preparazione della sezione di paraffina
<ol><li>Fissare l'arto posteriore destro in paraformaldeide al 4% a 4 °C per 48 ore.</li>
	<li>Decalcificare: Lavare delicatamente i campioni con 1x PBS per 10 min 3 volte. Decalcificare i campioni in EDTA al 15% (150 g DI EDTA in 800 mL di ddH2O e 100 mL di 10x PBS) con un decalcificatore ad ultrasuoni per 3-4 settimane fino a quando le ossa non possono essere piegate. Sostituire con liquido decalcificante fresco a giorni diversi.</li>
	<li>Lavare delicatamente i campioni 3 volte con 1x PBS e poi immergerli in 75% di etanolo a 4 °C durante la notte.</li>
	<li>Disidratazione: Il secondo giorno, immergere sequenzialmente i campioni in etanolo al 95%, etanolo al 100% e xilene, ciascuno per 1 h due volte.</li>
	<li>Immergere i campioni in paraffina 1/2 di xilene 1/2 per 30 minuti. Immergere gli esemplari in paraffina a 65 °C durante la notte.</li>
	<li>Incorpora: selezionare un serbatoio di incorporamento adatto per l'incorporamento. Posizionare la tibia uniformemente sotto. Posizionare il femore e la tibia con un angolo di 90°. Dopo che la paraffina è stata completamente raffreddata e solidificata, rimuoverla dal serbatoio di incorporamento. Numera gli esemplari e conservali a -20 °C durante la notte.</li>
	<li>Tagliare continuamente sezioni spesse 5 μm utilizzando il microtomo. Tagliare 20-40 sezioni. Stendere le sezioni su acqua a 37 °C, aderire agli scivoli al microscopio e cuocere a 42 °C durante la notte.</li>
</ol>4. Scansione e analisi micro-CT
<ol><li>Scansiona la femora sinistra con uno scanner micro-CT. Risoluzione: 10 μm; Tensione: 70 kV; Corrente: 114 μA; Fliter: 0,5 mm Al; Fase di rotazione: 0,5°.</li>
	<li>Ricostruire immagini 3D dell'osso corticale e dell'osso trabecolare utilizzando il software di supporto dello scanner seguendo le istruzioni del produttore. Le ROM sono in una larghezza totale di 1 mm di osso trabecolare vicino alla piastra di crescita distale e in una sezione totale larga 1 mm dell'osso corticale al centro della femora.</li>
	<li>Calcolare i parametri quantitativi della microarchitettura: densità minerale ossea (BMD), frazione del volume osseo (BV/TV), spessore trabecolare (Tb.Th.), numero trabecolare (Tb.N.), separazione trabecolare (Tb.Sp.) e spessore osseo corticale (Ct.Th.).</li>
</ol>5. Colorazione TRAP
<ol><li>Cuocere le sezioni di paraffina a 65 °C per 30 minuti.</li>
	<li>Dewax: Immergere le sezioni in xilene per 10 min. Eseguire questo passaggio 3x con xilene fresco.</li>
	<li>Reidrato: Immergere le sezioni in sequenza in 100% etanolo, 95% etanolo, 70% etanolo e ddH2O, ciascuno per 5 min due volte.</li>
	<li>Preparare la soluzione di colorazione utilizzando il kit di colorazione TRAP seguendo le istruzioni del produttore e riscaldare a 37 °C. NOTA: La soluzione di colorazione TRAP deve essere preparata al momento immediatamente prima di ogni saggio.</li>
	<li>Aggiungere soluzione di colorazione da 50-100 μL a ciascun campione e incubare in una camera umida a 37 °C per 20-30 minuti. Controllare lo stato di colorazione degli osteoclasti al microscopio leggero ogni 5 minuti fino a quando non si possono vedere osteoclasti multinucleati rossi. Terminare la reazione con ddH2O.</li>
	<li>Controsostenibile in soluzione di ematossilina per 30 s. Creare un colore blu stabile per immersione in soluzione di ammoniaca all'1% per 1 minuto. Risciacquare in acqua del rubinetto che scorre lentamente.</li>
	<li>Montare le sezioni con copricapo utilizzando balsamo neutro e asciugare durante la notte.</li>
	<li>Cattura 3-5 campi di interesse al microscopio. Analizzare il perimetro trabecolare per immagine J: misurare la lunghezza della barra di scala (Ls) usando lo strumento 'linearetta ' come L1, quindi misurare la lunghezza del perimetro trabecolare usando lo strumento 'linea segmentata' come L2, la lunghezza fisica (Lp)= Ls*L2 /L1). Contare il numero di cellule positive trap con più di tre nuclei.</li>
</ol>6. Doppia etichettatura rossa calcein e alizarina
<ol><li>Preparazione del campione: Iniettare per via intraperitoneale 20 mg/kg di calceina (1 mg/mL in soluzione NaHCO3 al 2%) il giorno 0 e 25 mg/kg di alizarina rossa S (AL, 2 mg/mL in H2O) il giorno 4. Sacrifica i topi il giorno 7. Dissociare con cura le tibia e fissarlo in paraformaldeide al 4% a 4 °C per 48 ore.</li>
	<li>Disidratazione: Dopo la fissazione, lavare delicatamente la tibiae 3x con 1x PBS. Immergere sequenzialmente i campioni in etanolo al 95%, etanolo al 100% e xilene per 5 minuti due volte separatamente.</li>
	<li>Immergere i campioni in acetone per 12 ore, in 1/2 acetone 1/2 resina per 2 ore e in resina pura in un forno di essiccazione durante la notte. NOTA: La resina è stata preparata con resina disponibile in commercio (ad esempio, Embed 812 Resin) secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Incorporare: Aggiungere la resina pura in un serbatoio di incorporamento in gel di silice adatto e posizionare delicatamente i campioni per evitare bolle. Polimerizzare la resina in un forno di essiccazione a 60 °C per 48 ore.</li>
	<li>Tagliare continuamente i provini in sezioni spesse 5 μm con un microtomo rotante. Conservare il resto dei campioni con essiccante a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aderire alle sezioni con pinzette in una goccia di alcol al 75%. Montare le sezioni con coprispasmi utilizzando balsamo neutro. Cattura l'etichettatura a fluorescenza rossa e verde con un microscopio a fluorescenza.</li>
	<li>Misurare la larghezza tra due linee di etichettatura (Ir.L.Wi), perimetro trabecolare a etichetta singola (sL.Pm), perimetro trabecolare a doppia etichetta (dL.Pm) e perimetro trabecolare totale (Tb.Pm). Calcolare il tasso di apposizione minerale (MAR) e il tasso di formazione ossea (BFR/BS). MAR = Ir.L.Wi/interval days. BFR/BS= (dL.Pm±sL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*100 %.</li>
</ol>

<ol><li>Zaidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+remodeling+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Skeletal remodeling in health and disease.</a> Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).</li>
<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
<li>Cummings, S. R., Melton, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+outcomes+of+osteoporotic+fractures%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures.</a> Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).</li>
<li>Black, D. M., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Practice.+Postmenopausal+Osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clinical Practice. Postmenopausal Osteoporosis.</a> New England Journal of Medicine. 374 (3), 254-262 (2016).</li>
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<li>Yu, H., Lee, H., Herrmann, A., Buettner, R., Jove, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+STAT3+signalling+in+cancer%3A+new+and+unexpected+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Revisiting STAT3 signalling in cancer: new and unexpected biological functions.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (11), 736-746 (2014).</li>
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<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblast%2Fosteocyte-specific+inactivation+of+Stat3+decreases+load-driven+bone+formation+and+accumulates+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Osteoblast/osteocyte-specific inactivation of Stat3 decreases load-driven bone formation and accumulates reactive oxygen species.</a> Bone. 49 (3), 404-411 (2011).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+controls+osteoclast+differentiation+and+bone+homeostasis+by+regulating+NFATc1+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">STAT3 controls osteoclast differentiation and bone homeostasis by regulating NFATc1 transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (42), 15395-15407 (2019).</li>
<li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+prevents+bone+loss+via+estrogen+receptor+alpha+and+induction+of+Fas+ligand+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts.</a> Cell. 130 (5), 811-823 (2007).</li>
<li>Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Cre-LoxP+system%3A+general+principles+to+determine+tissue-specific+roles+of+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+animal+research%22%5BJournal%5D)">Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes.</a> Laboratory animal research. 34 (4), 147-159 (2018).</li>
<li>Minkin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+acid+phosphatase%3A+tartrate-resistant+acid+phosphatase+as+a+marker+of+osteoclast+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Bone acid phosphatase: tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function.</a> Calcified Tissue International. 34 (3), 285-290 (1982).</li>
<li>Vaaraniemi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+machinery+for+matrix+degradation+in+bone-resorbing+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 19 (9), 1432-1440 (2004).</li>
<li>Ljusberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+excision+of+a+repressive+loop+domain+in+tartrate-resistant+acid+phosphatase+by+cathepsin+K+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proteolytic excision of a repressive loop domain in tartrate-resistant acid phosphatase by cathepsin K in osteoclasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28370-28381 (2005).</li>
<li>Janckila, A. J., Takahashi, K., Sun, S. Z., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naphthol-ASBI+phosphate+as+a+preferred+substrate+for+tartrate-resistant+acid+phosphatase+isoform+5b%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Naphthol-ASBI phosphate as a preferred substrate for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 16 (4), 788-793 (2001).</li>
<li>Janckila, A. J., Li, C. Y., Lam, K. W., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytochemistry+of+tartrate-resistant+acid+phosphatase.+Technical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The cytochemistry of tartrate-resistant acid phosphatase. Technical considerations.</a> American Journal of Clinical Pathology. 70 (1), 45-55 (1978).</li>
<li>Janckila, A. J., Simons, R. M., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+immunoassay+for+tartrate-resistant+acid+phosphatase+isoform+5b+using+the+fluorogenic+substrate+naphthol+ASBI-phosphate+and+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%3A+International+Journal+of+Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Alternative immunoassay for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b using the fluorogenic substrate naphthol ASBI-phosphate and heparin.</a> Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 347 (1-2), 157-167 (2004).</li>
<li>Janckila, A. J., Yam, L. T., Li, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoalkaline+phosphatase+cytochemistry.+Technical+considerations+of+endogenous+phosphatase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunoalkaline phosphatase cytochemistry. Technical considerations of endogenous phosphatase activity.</a> American Journal of Clinical Pathology. 84 (4), 476-480 (1985).</li>
<li>Solberg, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+tartrate-resistant+Acid+phosphatase+expression+in+osteoblasts+and+osteocytes+in+experimental+osteoporosis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Increased tartrate-resistant Acid phosphatase expression in osteoblasts and osteocytes in experimental osteoporosis in rats.</a> Calcified Tissue International. 94 (5), 510-521 (2014).</li>
<li>Tambutté, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcein+labelling+and+electrophysiology%3A+insights+on+coral+tissue+permeability+and+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings.+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Calcein labelling and electrophysiology: insights on coral tissue permeability and calcification.</a> Proceedings. Biological Sciences. 279 (1726), 19-27 (2012).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lkb1+deletion+in+periosteal+mesenchymal+progenitors+induces+osteogenic+tumors+through+mTORC1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 1895-1909 (2019).</li>
<li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR%2FRaptor+signaling+is+critical+for+skeletogenesis+in+mice+through+the+regulation+of+Runx2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">mTOR/Raptor signaling is critical for skeletogenesis in mice through the regulation of Runx2 expression.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (11), 1886-1899 (2017).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylase+LSD1+regulates+bone+mass+by+controlling+WNT7B+and+BMP2+signaling+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Research%22%5BJournal%5D)">Histone demethylase LSD1 regulates bone mass by controlling WNT7B and BMP2 signaling in osteoblasts.</a> Bone Research. 6, 14(2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I modelli di topi geneticamente modificati sono comunemente utilizzati per studiare il meccanismo e il trattamento farmaceutico della malattiaumana 13. I topi Ctsk-Cre sono stati ampiamente utilizzati per studi funzionali di osteoclasti6. Il presente studio ha descritto i protocolli dei metodi per analizzare il fenotipo scheletrico e studiare i geni critici che controllano l'attività osteoclasta in vivo.
L'analisi istologica è il miglior...

L'osso scheletrico è il principale organo portante del corpo umano ed è sotto pressione sia dall'ambiente interno che da quello esterno durante la camminata e l'eserciziofisico 1. Per tutta la vita, le ossa passano continuamente attraverso l'autori rinnovamento, che è bilanciato da osteoblasti e osteoclasti. Il processo di sgombero di osteoclasti che cancellano vecchie ossa e osteoblasti formando nuovo osso mantiene l'omeostasi e la funzione meccanica del sistemascheletrico 2. Il disturbo dell'equilibrio può indurre malattie metaboliche ossee, come l'osteoporosi. L'osteoporosi, causata dall'eccesso di attività osteoclastica, è prevalente a livello globale e causa notevoli perdite economichealla società 2,3,4. In base al numero limitato di farmaci disponibili per il trattamento dell'osteoporosi e al loro rischio di effettiavversi 4, è importante svelare i dettagli della formazione e dell'attività dell'osteoclasta.
Gli osteoclasti derivati dal lignaggio ematopoietico monocito/macrofago hanno nuclei multipli (possono avere da 2 a 50 nuclei) e sono grandi (di solito superiori a 100 μm di diametro)2. Sebbene l'esplorazione dei meccanismi e lo screening dei farmaci per i disturbi osteoclastici siano stati ampiamente migliorati attraverso la coltura osteoclasta in vitro, le complicate reazioni organiche rendono le prove in vivo indispensabili per la terapia mirata. A causa delle somiglianze genetiche e fisiopatofiche tra topi e esseri umani, i modelli di topi geneticamente modificati sono comunemente utilizzati per studiare i meccanismi e i trattamenti farmaceutici delle malattie umane in vivo6. Il sistema Cre-loxP è una tecnologia ampiamente utilizzata per l'editing genico del topo e ha permesso ai ricercatori di indagare le funzioni geniche in modo specifico per tessuti /cellule 5. La catepsina K (CSTK) è una proteasi cisteina secreta dagli osteoclasti che può degradare il collagene osseo8. È ben accettato che il CTSK sia espresso selettivamente negli osteoclasti maturi; pertanto, i topi Ctsk-Cre sono considerati uno strumento utile per studi funzionali sugli osteoclasti ed è stato utilizzato6.
Il trasduttore di segnale e attivatore della famiglia di trascrizione (STAT) è classico e altamente significativo nella progressione e nello sviluppo dell'immunità edel cancro 7,8. Tra sette STATISTICHE, STAT3 è segnalato per essere il più rilevante per l'omeostasi ossea9,10. Diversi studi in vivo hanno riportato che l'inattivazione specifica di STAT3 negli osteoblasti diminuisce la formazioneossea 9,10. Tuttavia, le prove solide riguardanti la partecipazione di STAT3 alla formazione di osteoclasti e al metabolismo osseo in vivo sono ancora limitate. Recentemente, abbiamo fornito prove in vivo con un modello di topo di cancellazione Stat3 specifico per osteoclasta(Stat3fl/fl; Ctsk-Cre, di seguito chiamato Stat3Ctsk) che STAT3 partecipa alla differenziazione osteoclasta e al metabolismoosseo 11. Nel presente studio, descriviamo i metodi e i protocolli che abbiamo usato per analizzare i cambiamenti nella massa ossea, istomorfologia ossea e anabolismo osseo e catabolismo dei topi Stat3Ctsk al fine di studiare l'influenza della cancellazione STAT3 specifica dell'osteoclasta sull'omeostasi ossea.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di paraformaldeide al 4%</td><td>Sangon biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td>E672002</tr><tr><td>Acetone</td><td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>80000360</tr><tr><td>Alizarin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di ammoniaca</td><td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Ctsk-Cre mouse</td><td></td><td></td><td>un regalo da S. Kato, Università di Tokyo, Tokyo, Giappone</td></tr><tr><td>DDSA</td><td>Scienze di microscopia elettronica</td><td>13710</td><td></td></tr><tr><td>DeCa RapidlyDecalcifier</td><td>Pro-Cure</td><td>DX1100</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>Scienze di microscopia elettronica</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EDTA Shanghai Reagente Sperimentale Co., Ltd.</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>EMBED 812 RESIN</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>microscopio a fluorescenza</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di ematossilina</td><td>Beyotime Biotechanology</td><td>C0107</td><td></td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>Scanco Medical AG</td><td>&mu; CT 80</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Shanghai Reagente sperimentale Co., Ltd.</td><td></td><td></td>10018918</tr><tr><td>Balsamo neutro</td><td>Sangon biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td>E675007</tr><tr><td>NMA</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>19000</td><td></td></tr><tr><td>Paraffina</td><td>Sangon biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtomo rotativo</td> A601889 <td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Stat3fl/fl topi</td><td>GemPharmatech Co., Ltd</td><td>Kit</td> di colorazione D000527 <td></td></tr><tr><td>TRAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>xilene</td><td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi del fenotipo scheletrico di un modello di mouse di eliminazione stat3 condizionale

Skeletal Phenotype Analysis of a Conditional Stat3 Deletion Mouse Model

I modelli di topo transgenico sono potenti per comprendere i geni critici che controllano la differenziazione e l'attività dell'osteoclasta e per studiare i meccanismi e i trattamenti farmaceutici dell'osteoporosi. I topi Cathepsin K (Ctsk)-Cre sono stati ampiamente utilizzati per studi funzionali sugli osteoclasti. Il trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione 3 (STAT3) è rilevante nell'omeostasi ossea, ma il suo ruolo negli osteoclasti in vivo rimane scarsamente definito. Per fornire la prova in vivo che STAT3 partecipa alla differenziazione dell'osteoclasta e al metabolismo osseo, abbiamo generato un modello di topo di cancellazione Stat3 specifico dell'osteoclasta(Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre) e analizzato il suo fenotipo scheletrico. La scansione micro-CT e la ricostruzione 3D implicavano un aumento della massa ossea nei topi knockout condizionali. Colorazione H&E, colorazione doppia rossa di calceina e alizarina e colorazione della fosfatasi acida resistente al tartrato (TRAP) sono state eseguite per rilevare il metabolismo osseo. In breve, questo protocollo descrive alcuni metodi e tecniche canoniche per analizzare il fenotipo scheletrico e studiare i geni critici che controllano l'attività osteoclasta in vivo.

Utilizzando il presente protocollo, sono stati generati topi di cancellazione Stat3 specifici osteoclasti per studiare l'influenza della cancellazione di STAT3 sulla differenziazione dell'osteoclasta. I topi Stat3Ctsk e i loro compagni di cucciolata di tipo selvatico (WT) sono stati allevati e tenuti dopo il genotipizzazione. I macrofagi del midollo osseo sono stati isolati e coltivati in osteoclasti e la cancellazione di STAT3 nei topi Stat3Ctsk è stata ...

Questo protocollo descrive un metodo canonico per comprendere i geni critici che controllano l'attività osteoclasta in vivo. Questo metodo utilizza un modello di topo transgenico e alcune tecniche canoniche per analizzare il fenotipo scheletrico.

Analisi del fenotipo scheletrico di un modello di mouse di eliminazione Stat3 condizionale

Transgenic mouse models are powerful for understanding the critical genes controlling osteoclast differentiation and activity, and for studying mechanisms ...

I modelli murini geneticamente modificati sono strumenti potenti per studiare i meccanismi delle malattie umane in vivo. L'analisi del fenotipo scheletrico dei topi è la base della ricerca scheletrica. Questa particella descrive alcune tecniche tipiche per l'analisi del fenotipo scheletrico che possono essere interessanti per coloro che sono nuovi alla ricerca sul tessuto scheletrico.Quando provi questa particella, tieni presente che gli esperimenti sugli animali richiedono tempo, quindi raccogli il maggior numero possibile di campioni di alta qualità durante ogni esperimento, anche se non ne hai bisogno a breve termine. Inizia mettendo un topo eutanasia in posizione supina e dislocando delicatamente le articolazioni bilaterali dell'anca a mano. Usa le forbici oftalmiche per tagliare verticalmente la pelle dalla tibia distale e poi rimuovere tutta la pelle dall'arto posteriore.Tagliare il legamento articolare dell'articolazione dell'anca destra e dell'articolazione del ginocchio con le forbici per separare l'arto posteriore. Quindi tagliare l'osso ad entrambe le estremità per immergere completamente l'osso in PFA al 4%. Tagliare il trocantere e la giunzione del perone.Immergere l'arto posteriore in PFA al 4%, mantenendo l'arto posteriore destro per la sezionamento della paraffina. Taglia i legamenti articolari dell'anca sinistra e delle articolazioni del ginocchio con le forbici e rimuovi delicatamente i tessuti molli. Separare la tibia e il femore e immergerli separatamente in etanolo al 75%.Conservare i femori per la micro TAC e le tibie per la doppia marcatura con calceina e alizarina. Per preparare le sezioni di paraffina, lavare delicatamente l'arto posteriore destro fisso tre volte con PBS per 10 minuti per lavaggio. Quindi decalcificarlo in EDTA al 15% con un decalcificante a ultrasuoni per tre o quattro settimane fino a quando le ossa possono essere piegate, sostituendo il fluido decalcificante a giorni alterni.Dopo la decalcificazione, lavare i campioni tre volte con PBS e immergerli in etanolo al 75% a quattro gradi Celsius durante la notte. Il secondo giorno, immergere in sequenza i campioni in etanolo al 95%, etanolo al 100% e xilene per un'ora ciascuno. Immergere i campioni in metà xilene e metà paraffina per 30 minuti, quindi in paraffina a 65 gradi Celsius per una notte.Per incorporare il campione, immergerlo in paraffina, posizionando il femore e la tibia con un angolo di 90 gradi. Quando la paraffina si è completamente raffreddata, rimuovere i campioni dal serbatoio di inclusione. Numerali e conservali a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius durante la notte.Infornate le sezioni di paraffina a 65 gradi Celsius per 30 minuti, poi scioglietele immergendole nello xilene per 10 minuti. Immergere le sezioni tre volte con xilene fresco ogni volta. Reidratare le sezioni immergendole in sequenza in etanolo al 100%, etanolo al 95%, etanolo al 70% e acqua distillata per cinque minuti ciascuna.Preparare la soluzione colorante utilizzando il kit di colorazione TRAP e riscaldarla a 37 gradi Celsius. Aggiungere da 50 a 100 microlitri di soluzione colorante a ciascuna sezione e incubarle in una camera umida a 37 gradi Celsius per 20-30 minuti. Controllare lo stato di colorazione degli osteoclasti al microscopio ottico ogni cinque minuti fino a quando non è possibile vedere gli osteoclasti multinucleati rossi.Quindi terminare la reazione con acqua. Controcolorare le sezioni in soluzione di ematossilina per 30 secondi e creare un colore blu stabile immergendole in una soluzione di ammoniaca all'1% per un minuto. Quindi sciacquarli in acqua di rubinetto che scorre lentamente.Montare le sezioni utilizzando vetrini coprioggetti con balsamo neutro e asciugarle durante la notte. Cattura da tre a cinque campi visivi con un microscopio e analizza il perimetro trabecolare con l'immagine J.Utilizzare lo strumento linea retta per misurare la lunghezza della barra della scala come L1. Quindi utilizzare lo strumento linea segmentata per misurare la lunghezza del perimetro trabecolare come L2. Calcola la lunghezza fisica e conta il numero di cellule TRAP positive con più di tre nuclei. Dopo la fissazione, lavare delicatamente le tibie tre volte con PBS e immergere in sequenza i campioni in etanolo al 95%, etanolo al 100% e xilene per cinque minuti ciascuno.Immergere i campioni in acetone per 12 ore e metà acetone e metà resina per due ore, e in resina pura in un forno di essiccazione per una notte. Aggiungere la resina pura in un serbatoio di inclusione in gel di silice adatto e posizionare i campioni nel serbatoio evitando bolle. Polimerizzare la resina in un forno di essiccazione a 60 gradi Celsius per 48 ore.Tagliare i campioni in sezioni spesse cinque micrometri in modo continuo con un microtomo rotante e conservare il resto dei campioni con essiccante a temperatura ambiente. Far aderire le sezioni con una pinzetta in una goccia di etanolo al 75% e montarle con vetrini coprioggetti utilizzando balsamo neutro. Cattura la marcatura a fluorescenza rossa e verde con un microscopio a fluorescenza.I topi con delezione Stat3 specifici per osteoclasti sono stati generati per studiare l'influenza della delezione di Stat3 sulla differenziazione degli osteoclasti. La ricostruzione femorale e l'analisi quantitativa mediante micro CT hanno indicato che la massa ossea dei topi Stat3 Ctsk era aumentata rispetto ai topi wild type. L'istomorfologia del femore di topi wild type e Stat3 Ctsk è stata esaminata mediante colorazione H ed E.L'attività osteoclastogenica è stata rilevata utilizzando la colorazione TRAP. Gli osteoclasti sono grandi cellule TRAP positive con nuclei multipli. Il numero di osteoclasti positivi per TRAP era inferiore nei topi Stat3 Ctsk, rispetto ai topi wild type, indicando che la carenza di Stat3 comprometteva la formazione di osteoclasti.L'osteogenesi è stata misurata con la doppia marcatura del rosso di calceina e alizarina. L'area tra la calceina e la fluorescenza rossa dell'alizarina rappresenta l'osso di nuova formazione. La Stat3 deleta negli osteoclasti non ha influenzato l'anabolismo osseo.Sezioni di paraffina sagittale in cui la cartilagine in seguito era simmetrica e che mostrava che qui veniva utilizzata una chiara linea a forma di M. Per gli studi, includeremo più caratteristiche del sistema scheletrico, come le proprietà meccaniche.

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