Analisi del fenotipo scheletrico di un modello di mouse di eliminazione Stat3 condizionale

I modelli murini geneticamente modificati sono strumenti potenti per studiare i meccanismi delle malattie umane in vivo. L'analisi del fenotipo scheletrico dei topi è la base della ricerca scheletrica. Questa particella descrive alcune tecniche tipiche per l'analisi del fenotipo scheletrico che possono essere interessanti per coloro che sono nuovi alla ricerca sul tessuto scheletrico.

Quando provi questa particella, tieni presente che gli esperimenti sugli animali richiedono tempo, quindi raccogli il maggior numero possibile di campioni di alta qualità durante ogni esperimento, anche se non ne hai bisogno a breve termine. Inizia mettendo un topo eutanasia in posizione supina e dislocando delicatamente le articolazioni bilaterali dell'anca a mano. Usa le forbici oftalmiche per tagliare verticalmente la pelle dalla tibia distale e poi rimuovere tutta la pelle dall'arto posteriore.

Tagliare il legamento articolare dell'articolazione dell'anca destra e dell'articolazione del ginocchio con le forbici per separare l'arto posteriore. Quindi tagliare l'osso ad entrambe le estremità per immergere completamente l'osso in PFA al 4%. Tagliare il trocantere e la giunzione del perone.

Immergere l'arto posteriore in PFA al 4%, mantenendo l'arto posteriore destro per la sezionamento della paraffina. Taglia i legamenti articolari dell'anca sinistra e delle articolazioni del ginocchio con le forbici e rimuovi delicatamente i tessuti molli. Separare la tibia e il femore e immergerli separatamente in etanolo al 75%.

Conservare i femori per la micro TAC e le tibie per la doppia marcatura con calceina e alizarina. Per preparare le sezioni di paraffina, lavare delicatamente l'arto posteriore destro fisso tre volte con PBS per 10 minuti per lavaggio. Quindi decalcificarlo in EDTA al 15% con un decalcificante a ultrasuoni per tre o quattro settimane fino a quando le ossa possono essere piegate, sostituendo il fluido decalcificante a giorni alterni.

Dopo la decalcificazione, lavare i campioni tre volte con PBS e immergerli in etanolo al 75% a quattro gradi Celsius durante la notte. Il secondo giorno, immergere in sequenza i campioni in etanolo al 95%, etanolo al 100% e xilene per un'ora ciascuno. Immergere i campioni in metà xilene e metà paraffina per 30 minuti, quindi in paraffina a 65 gradi Celsius per una notte.

Per incorporare il campione, immergerlo in paraffina, posizionando il femore e la tibia con un angolo di 90 gradi. Quando la paraffina si è completamente raffreddata, rimuovere i campioni dal serbatoio di inclusione. Numerali e conservali a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius durante la notte.

Infornate le sezioni di paraffina a 65 gradi Celsius per 30 minuti, poi scioglietele immergendole nello xilene per 10 minuti. Immergere le sezioni tre volte con xilene fresco ogni volta. Reidratare le sezioni immergendole in sequenza in etanolo al 100%, etanolo al 95%, etanolo al 70% e acqua distillata per cinque minuti ciascuna.

Preparare la soluzione colorante utilizzando il kit di colorazione TRAP e riscaldarla a 37 gradi Celsius. Aggiungere da 50 a 100 microlitri di soluzione colorante a ciascuna sezione e incubarle in una camera umida a 37 gradi Celsius per 20-30 minuti. Controllare lo stato di colorazione degli osteoclasti al microscopio ottico ogni cinque minuti fino a quando non è possibile vedere gli osteoclasti multinucleati rossi.

Quindi terminare la reazione con acqua. Controcolorare le sezioni in soluzione di ematossilina per 30 secondi e creare un colore blu stabile immergendole in una soluzione di ammoniaca all'1% per un minuto. Quindi sciacquarli in acqua di rubinetto che scorre lentamente.

Montare le sezioni utilizzando vetrini coprioggetti con balsamo neutro e asciugarle durante la notte. Cattura da tre a cinque campi visivi con un microscopio e analizza il perimetro trabecolare con l'immagine J.Utilizzare lo strumento linea retta per misurare la lunghezza della barra della scala come L1. Quindi utilizzare lo strumento linea segmentata per misurare la lunghezza del perimetro trabecolare come L2. Calcola la lunghezza fisica e conta il numero di cellule TRAP positive con più di tre nuclei. Dopo la fissazione, lavare delicatamente le tibie tre volte con PBS e immergere in sequenza i campioni in etanolo al 95%, etanolo al 100% e xilene per cinque minuti ciascuno.

Immergere i campioni in acetone per 12 ore e metà acetone e metà resina per due ore, e in resina pura in un forno di essiccazione per una notte. Aggiungere la resina pura in un serbatoio di inclusione in gel di silice adatto e posizionare i campioni nel serbatoio evitando bolle. Polimerizzare la resina in un forno di essiccazione a 60 gradi Celsius per 48 ore.

Tagliare i campioni in sezioni spesse cinque micrometri in modo continuo con un microtomo rotante e conservare il resto dei campioni con essiccante a temperatura ambiente. Far aderire le sezioni con una pinzetta in una goccia di etanolo al 75% e montarle con vetrini coprioggetti utilizzando balsamo neutro. Cattura la marcatura a fluorescenza rossa e verde con un microscopio a fluorescenza.

I topi con delezione Stat3 specifici per osteoclasti sono stati generati per studiare l'influenza della delezione di Stat3 sulla differenziazione degli osteoclasti. La ricostruzione femorale e l'analisi quantitativa mediante micro CT hanno indicato che la massa ossea dei topi Stat3 Ctsk era aumentata rispetto ai topi wild type. L'istomorfologia del femore di topi wild type e Stat3 Ctsk è stata esaminata mediante colorazione H ed E.

L'attività osteoclastogenica è stata rilevata utilizzando la colorazione TRAP. Gli osteoclasti sono grandi cellule TRAP positive con nuclei multipli. Il numero di osteoclasti positivi per TRAP era inferiore nei topi Stat3 Ctsk, rispetto ai topi wild type, indicando che la carenza di Stat3 comprometteva la formazione di osteoclasti.

L'osteogenesi è stata misurata con la doppia marcatura del rosso di calceina e alizarina. L'area tra la calceina e la fluorescenza rossa dell'alizarina rappresenta l'osso di nuova formazione. La Stat3 deleta negli osteoclasti non ha influenzato l'anabolismo osseo.

Sezioni di paraffina sagittale in cui la cartilagine in seguito era simmetrica e che mostrava che qui veniva utilizzata una chiara linea a forma di M. Per gli studi, includeremo più caratteristiche del sistema scheletrico, come le proprietà meccaniche.