Preparazione dei tessuti e immunostaining dei tessuti craniofacciali del topo e dell'osso non decalcolato

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per rilevare e quantificare i livelli di proteine durante la morfogenesi/patogenesi craniofacciale immunostaining usando come esempi i tessuti craniofacciali dei topi. Inoltre, descriviamo un metodo per la preparazione e la criosezione dei tessuti duri non decalcolati dai giovani topi per l'immunostaining.

Qui presentiamo il nostro semplice protocollo per il rilevamento dell'immunofluorescenza sulle proteine su materiali sesati. Questo metodo non richiede il recupero dell'antigene. Useremo teste di topo, compresi i tessuti duri non calcificati.

Il principale vantaggio di questa tecnica è saltare il recupero dell'antigene e la decalcificazione dei tessuti duri. Questi portano a una buona qualità dei risultati di immunosottenzione. Questo metodo consente inoltre di risparmiare tempo e manodopera.

Questo metodo è applicabile anche ad altri tessuti con opportune modifiche. Per creare belle sezioni da tessuti non calcificati, sezionare ulteriormente il tessuto bersaglio per tagliare ulteriormente i tessuti circostanti e, se necessario, trattare i campioni con 10%EDTA a quattro gradi Celsius per due giorni prima della crioprotezione. La dimostrazione visiva fornisce una spiegazione dettagliata e chiara della procedura di questo metodo.

Per iniziare, preparare un piatto da 10 centimetri e diversi piatti da 3,5 centimetri contenenti PBS e un piatto di coltura da 12 po 'contenente due millilitri del 4% di PFA in PBS in ogni pozzo per ogni topo incinta e metterli tutti sul ghiaccio. Per sezionare embrioni da topi gravidi, afferrare la pelle sotto il centro del ventre di un topo eutanasiato con le forcep, tagliare solo la pelle e quindi tirare delicatamente la pelle per separarla dalla parete muscolare addominale sottostante. Seguendo la stessa linea dell'incisione cutanea, tagliare nella cavità addominale.

Rimuovere l'utero contenente una stringa di embrioni. Quindi, rimuovere gli embrioni tagliando delicatamente la parete uterina, che rimuoverà i tessuti extraembrionici come il sacco vitellino e l'amnione. Tagliare e isolare la testa da ogni embrione, e con le forcep trasferire ogni testa in un pozzo separato di una piastra da 12 po 'contenente il 4%PFA.

Incubare a quattro gradi Celsius per quattro ore da riparare. Risciacquare le teste in PBS a quattro gradi Celsius con tremori delicati per 12 ore. Per crioproteggere le teste, trasferirle utilizzando le forcep in una nuova piastra da 12 pompoli contenente due millilitri di saccarosio al 30% in PBS.

Incubare con delicata agitazione a quattro gradi Celsius fino a quando le teste affondano sul fondo del piatto. Per incorporare le teste crioprotetti, trasferirle in uno stampo contenente composto ottimale per la temperatura di taglio ed equilibrare per diversi minuti. Utilizzando le forcep, regolate la posizione e la direzione dei campioni in modo che il lato rifilato dei campioni sia verso la parte inferiore dello stampo di incorporamento.

Quindi, posizionare lo stampo sul ghiaccio secco per congelare e conservare in un sacchetto di plastica a meno 80 gradi Celsius fino a quando non è pronto per la criosezione. Per il tessuto postnatale, dopo aver rimosso la pelle e i tessuti adiposi di un topo eutanasiato di tre settimane o tre mesi, tagliare e isolare la testa e rimuovere la mattidibile. Quindi, fissare e crioproteggere la testa come fatto con le teste dell'embrione.

Incorporare in gelatina all'8% in modo simile alle teste degli embrioni negli OCT e tenere i criomoldi in un sacchetto di plastica a meno 80 gradi Celsius fino alla criosezione. Impostare la temperatura del criostato appropriata. Posizionare i campioni nella camera criostatica per circa 30 minuti per equilibrare alla temperatura del criostato.

Rimuovere il blocco con il campione dal Cryomold e montarlo con una goccia oct sul mandrino del campione e congelarlo, assicurandosi di mantenere il lato rifilato del campione più lontano dal mandrino e rivolto verso l'operatore. Caricare il mandrino montato su blocco sul supporto dell'oggetto cryostat. Regolare il supporto della lama in modo che l'angolo della lama sia da tre a cinque gradi rispetto al campione.

Raccogliere sezioni di 10 micrometri su vetrini del microscopio rivestiti. Lasciare le sezioni a temperatura ambiente fino a completa asciugatura, quindi conservarle a meno 80 gradi Celsius. Per iniziare con la colorazione, eseguire le diapositive da meno 80 gradi Celsius e mantenerle a temperatura ambiente per un'ora per asciugare all'aria le sezioni.

Risciacquare le diapositive nello 0,1%PBST tre volte per cinque minuti ciascuna per lavare lo Strumento di personalizzazione di Office e permeabilizzare le sezioni. Aggiungere 200 microlitri di soluzione di blocco a ogni diapositiva e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, rimuovere la soluzione di blocco senza risciacquare la diapositiva.

Aggiungere 100 microlitri di anticorpi primari diluiti in soluzione di blocco ad ogni diapositiva e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Risciacquare le diapositive con PBS tre volte per 10 minuti ciascuna a temperatura ambiente. Aggiungere 100 microlitri di anticorpi secondari diluiti in soluzione di blocco e incubare per un'ora a temperatura ambiente, protetti dalla luce.

Risciacquare in PBS tre volte per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente, ancora protetto dalla luce. Per montare le diapositive, aggiungere due gocce di supporto anti dissolvenza con DAPI su ogni diapositiva, coprire con un coverslip e memorizzare a quattro gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'immagine. Le ossa frontali degli embrioni di controllo erano positive per pSmad1/5/9, fattori di segnalazione BMP a valle, e Ki67, un marcatore di proliferazione cellulare.

Negli embrioni mutanti BMPR1A specifici della cresta neurale, attivati in modo costitutivo, tuttavia, i livelli di pSmad1/5/9 sono stati aumentati mentre i livelli di Ki67 sono diminuiti. Inoltre, nelle ossa frontali degli embrioni mutanti sono state osservate più cellule apoptotiche di quelle degli embrioni di controllo. Le criosezioni coronali delle teste incorporate nella gelatina mostrano chiaramente il segnale GFP e il segnale RFP da una cassetta tdTomato nell'osso nasale e nei tessuti nasali, dimostrando che la gelatina non interferisce con i segnali fluorescenti.

Quando queste sezioni sono state immunososteniate per SOX9 o Osterix ed E11/Podoplanina, sono state ottenute sezioni di buona qualità dalla maggior parte dei tessuti duri di tre settimane. D'altra parte, con campioni di tre mesi, sezioni di buona qualità sono state ottenute solo in alcuni dei tessuti duri, compresi i compartimenti trabecolari del femore, i tessuti nasali e il cranio, compresa la sutura nasale-premascella e le ossa circostanti della testa. Le cellule SOX9-positive sono state rilevate specificamente nei condrociti della piastra di crescita e dell'articolazione del femore e del setto nasale.

Nell'incisivo di tre settimane fa, SOX9 è stato rilevato nelle cellule mesenchimali. I risultati della doppia colorazione di Osterix ed E11 mostrano che Osterix è stato rilevato negli osteoblasti, mentre L'E11 è stato rilevato negli osteociti delle ossa del femore e della testa. Nell'incisivo di tre settimane, Osterix era positivo negli odontoblasti, mentre l'E11 era positivo nelle cellule mesenchimali follicolari.

Non sovrafissare i campioni con il 4%PFA. Per il sessificazione di tessuti duri non calcificati in gelatina, la temperatura migliore è inferiore a 25 gradi Celsius e inferiore. Seguendo questa procedura, i livelli di fluorescenza possono essere quantificati come descritto nel nostro protocollo.

Tali misurazioni forniranno dati informativi per mostrare la differenza del livello relativo di proteine tra i diversi gruppi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada alla colorazione doppia o tripla per ottenere modelli di co-espressione di diverse proteine. Il 4% di PFA è pericoloso.

Può causare allergie cutanee, gravi danni agli occhi, danni agli organi o cancro. Si prega di utilizzare dispositivi di protezione individuale e lavare accuratamente la pelle dopo la manipolazione.