Studi struttura-funzione nel topo cellule staminali embrionali Uso ricombinasi mediata Cassette Scambio

Le proteine ​​contengono spesso più domini che possono esercitare diverse funzioni cellulari. Gene knock-out (KO) non considerano questa diversità funzionale. Qui riportiamo un cambio cassette ricombinazione mediata (RMCE) approccio basato lo struttura-funzione in cellule staminali embrionali KO che consente la dissezione molecolare dei vari domini funzionali o varianti di una proteina.

L'obiettivo generale di questo metodo struttura-funzione è quello di sezionare a livello molecolare il ruolo di diversi domini proteici, o mutazioni rilevanti per la malattia, in cellule staminali embrionali di topo naive o differenziate. Questo metodo può aiutare a rivelare come diversi residui o domini di una proteina possono contribuire alla sua funzione in un dato contesto cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di indirizzare in modo molto efficiente i costrutti di salvataggio al genoma delle cellule staminali embrionali knock out, o cellule ES, e lo studio del loro ruolo in diversi tipi di cellule.

Per raggiungere questo obiettivo, combiniamo tre tecnologie altamente efficienti. Questi includono un migliore isolamento delle cellule staminali embrionali di topo, l'assemblaggio del fattore di targeting basato sulla ricombinazione e il targeting delle cellule ES tramite scambio di cassette mediato dalla ricombinazione o RMC. A dimostrare alcune delle procedure sarà Jinke D'Hont, un tecnico del mio laboratorio.

Lo scambio di cassette mediato da ricombinazione, o RMCE, consente lo scambio di frammenti di DNA tra un vettore e un locus genomico. La RMCE sfrutta i siti di ricombinazione etero-specifici che non reagiscono in modo crociato e che sono incorporati in un locus genomico. In presenza di un plasmide donatore che contiene un frammento di DNA affiancato dagli stessi siti etero-specifici, la ricombinasi inserirà questo frammento di DNA nel locus genomico compatibile con RMCE a causa della doppia traslocazione simultanea.

Solo dopo una corretta ricombinazione, il gene di resistenza alla neomicina senza promotore intrappolato nel sito di docking di Rosa 26, verrà ripristinato tramite un promotore PGK nel vettore di targeting in entrata, che rende la resistenza ai farmaci. Questo sistema di trappole per la resistenza alla neomicina si traduce in un'efficienza di targeting molto elevata, spesso vicina al 100%Il giorno prima dell'isolamento della blastocisti, aggiungere lo 0,1% di gelatina, a 12 piastre ben coltivate. E incubarli a 37 gradi Celsius per cinque minuti.

Aspirare la soluzione di gelatina. Quindi seminare un quarto di una fiala di fibroblasti embrionali di topo P2, o MEF, nel terreno MEF e dividere sulla piastra a 12 pozzetti. Incubare le piastre a 12 pozzetti di MEF in due millilitri di terreno MEF a 37 gradi Celsius.

E far crescere le cellule fino a un monostrato confluente. Quindi aggiungere 10 microgrammi per millilitro di semi di mitomicina ai pozzetti. E incubare le colture per tre ore a 37 gradi Celsius, per inattivare le cellule.

Dopo aver selezionato topi knock out eterozigoti contenenti una cassetta RMCE nel locus Rosa 26 secondo il protocollo di testo, impostare gli accoppiamenti per allevare topi knock out eterozigoti compatibili con RMCE, con topi knock out eterozigoti. La mattina seguente, controlla la presenza di tappi di copulazione sollevando la femmina dalla base del racconto ed esamina l'apertura vaginale per una massa biancastra. Se il tappo è difficile da vedere, con una sonda angolata, allargare leggermente le labbra della vulva, quindi separare le femmine tappate dai loro maschi.

Per raccogliere le blastocisti a 3,5 giorni dopo il coito, o DPC. Dopo l'eutanasia delle femmine gravide, praticare un'incisione medio-ventrale e utilizzare forbici sottili e pinze per sezionare l'utero e l'ovidotto. Quindi, piega un ago calibro 26 con un angolo di 45 gradi attaccato a una siringa da 1 millilitro riempita con terreno M2.

E inserire l'ago nell'estremità dell'utero più vicina all'ovidotto. Usa una pinza sottile per tenere l'ago in posizione mentre spingi lo stantuffo per lavare le blastocisti dall'utero nel coperchio di un piatto di 10 centimetri. L'utero si gonfierà, se il lavaggio ha successo.

Utilizzare una pipetta orale per raccogliere tutti gli embrioni in una goccia di terreno M2 e lavare gli embrioni due volte in una goccia di terreno M2. Subito dopo aver lavato gli embrioni, utilizzare PBS, per lavare due volte le cellule inattivate della mitomicina-C. Quindi, utilizzando una pipetta orale, piastrate ciascuna blastocisti su un pozzetto separato dei MEF trattati con mitomicina-C, in terreno cellulare SRES, integrati con pluripotente o 2I.

Incubare le colture a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Aggiornare il terreno cellulare SREF ogni due o tre giorni. Esaminare ogni blastocisti con uno stereomicroscopio a un ingrandimento 4X e verificare la schiusa e il distacco dallo strato MEF.

Dopo 10-12 giorni di coltura, sotto uno stereomicroscopio, utilizzare una pipetta P10 con puntali monouso, per raccogliere le singole escrescenze di icio. Trasferire ogni crescita in circa 10 microlitri di terreno in una piastra a 96 pozzetti a forma di V, contenente 30 microlitri per pozzetto di PBS. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 50 microlitri di tripsina allo 0,25% in ciascun pozzetto.

E incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per tre minuti. Aggiungere 100 microlitri di terreno cellulare ES contenente FPS pre-incubato e dissociare le escrescenze di icio in singole cellule pipettando da 10 a 15 volte. Quindi trasferire le cellule dissociate in piastre MEF a 96 pozzetti trattate con mitomicina-C.

Il giorno seguente, cambiare il supporto basato su SR. Espandi le celle ES in modo simile da piastre da 24 a 6 pozzetti. Dopo aver identificato i vettori CDNA salvati secondo il protocollo di testo, preparare una reazione LR da 10 microlitri utilizzando 100 nanogrammi di vettore CDNA di salvataggio, 150 nanogrammi di vettore RMCEDV1 pre-asportato e due microlitri di miscela di ricombinasi, contenente un'integrasi codificata dai fagi, un'escissionasi e un fattore ospite di integrazione batterica.

Incubare la reazione a 25 gradi Celsius per due ore. Per trasformare i vettori ricombinati, aggiungere 5 microlitri di ciascuna miscela, a 40 microlitri di batteri E.Coli competenti per shock termico, in un tubo con tappo a vite da 2 millilitri. E incubare il campione su ghiaccio per 20 minuti.

Quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Aggiungere un millilitro di LB di terreno alla provetta e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per un'ora. Piastra 50 microlitri su piastre di agar con ampicillina.

E crescere a 37 gradi Celsius durante la notte. Identifica le colonie con il vettore di puntamento corretto utilizzando una punta P200 per scegliere casualmente cinque colonie. Trasferisci la punta in una provetta di vetro contenente da due a cinque millilitri di terreno LB e fai crescere per una notte a 37 gradi Celsius.

Dopo aver estratto il DNA da ciascuna colonia, convalidare i campioni digerendo da 0,5 a due microgrammi di DNA e separare i campioni su un gel di agarosio all'1%. Avviare una coltura di cellule ES knock out compatibili con RMCE e farle passare almeno due volte su MEF, in terreno cellulare ES basato su FBS. Quindi dividere le cellule ES su una piastra gelatinizzata a sei pozzetti.

Il giorno seguente, utilizzare 1,5 millilitri di terreno di coltura ES a base di FBS per rinfrescare le cellule ES che sono confluenti per circa il 50%. Combinare un microgrammo di vettore di targeting RMCEDV1 pre-asportato, contenente CDNA di salvataggio, e un microgrammo di plasmide di espressione FLIPe, in 250 microlitri di terreno DMEM puro. Aggiungere sette microlitri di reagente di trasvezione a base di lipopectina a 250 microlitri di terreno DMEM puro.

E incubare la soluzione per cinque minuti a temperatura ambiente. Combina le soluzioni di DNA e lipopectina. E incubare la miscela a temperatura ambiente per 20 minuti.

Quindi pipettare la miscela di trasvezione sulle cellule ES rinfrescate e agitare delicatamente. Un giorno dopo la trasvezione, dividere tutte le cellule ES dalla provetta in un piatto di coltura di 10 centimetri, con uno strato confluente di DR4 MEFS e 10 millilitri di terreno cellulare ES basato su FPS. Due giorni dopo la trasvezione, selezionare i cloni di cellule ES con la corretta sostituzione della cassetta mediata da FLIP-e, aggiungendo G418 al terreno.

Come mostrato qui, l'uccisione massiccia di colonie non bersaglio dovrebbe essere visibile dopo tre o cinque giorni. Le colonie dovrebbero apparire dopo sette-10 giorni. Scegli queste colonie, quindi espandile e verifica i cloni come mostrato in precedenza in questo video.

Per differenziare le cellule ES in corpi embrioidi, o EB, dopo aver coltivato le cellule ES knock-out con costrutti di salvataggio guidati da Rosa 26 secondo il protocollo di testo, lasciare che le EB si formino nelle piastre non aderenti per 30 giorni. Rinfrescare il terreno ogni due o tre giorni trasferendo la sospensione EB in un tubo da 50 millilitri. E lasciare che gli EB si stabilizzino per gravità.

Rimuovere il surnatante, aggiungere un terreno fresco e trasferire la sospensione EB in un piatto di grado batterico. Analizzare le cellule ES e gli EB mediante immunofluorescenza e TEM, secondo il protocollo di testo. Utilizzando il metodo della funzione struttura, sono stati generati cinque vettori di targeting RMCEDV1 pre-asportati con un'efficienza del 100% e questi costrutti di salvataggio sono stati mirati tramite RMCE, per eliminare le cellule ES dalla catenina P120, con un'efficienza del 97% La morfologia dell'EB cistico può essere utilizzata come lettura fenotipica per lo screening di diversi costrutti di salvataggio.

Come prova di concetto, l'isoforma 1A della catenina P120 guidata da R26 ha salvato il fenotipo knock-out della catenina p120. Per verificare se l'ancoraggio indipendente dalla membrana E-caderina della catenina P120 consentisse la formazione di EB csitici, il motivo di targeting della membrana k-ras, CAAX, è stato fuso all'estremità carbossilica della catenina P120 e introdotto tramite RMCE, per eliminare le cellule ES dalla catenina P120, prima che le EB fossero prodotte da esse. Tuttavia, questo costrutto serve un negativo dominante che non consente il legame e la stabilizzazione della E-caderina.

E di conseguenza, non salva il fenotipo knock out della catenina p120. La transizione epitelio-mesenchimale, o EMT, è un processo di sviluppo essenziale che si verifica anche durante la differenziazione delle cellule ES. Quando espressi nella catenina p120 eliminano le cellule ES, gli induttori EMT, ZEB1, ZEB2 o lumaca che possono reprimere direttamente vari geni marcatori epiteliali come la E-caderina, non sono riusciti a ripristinare la formazione cistica di EB.

Una volta padroneggiate, le cellule ES compatibili con RMCE possono essere isolate entro un mese. I vettori di targeting compatibili con RMCE possono essere generati entro una settimana e il salvataggio mirato delle cellule ES può essere ottenuto entro un mese utilizzando questa tecnica, se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare RMCE per eseguire studi sulla funzione strutturale in cellule staminali embrionali naive o differenziate.