Un bioreattore multi-cue per valutare la capacità infiammatoria e rigenerativa dei biomateriali sotto flusso e allungamento

Finora, è stato davvero difficile identificare le relazioni di causa ed effetto tra emodinamica e rigenerazione del tessuto vascolare. E questo perché è difficile controllare i singoli carichi meccanici. Questo bioreattore ci consente di studiare meccanicamente gli effetti individuali e combinati dello stress puro e dell'allungamento ciclico sul potenziale rigenerativo di un'ampia varietà di innesti vascolari di ingegneria tissutale.

A dimostrare questa procedura sarà Suzanne Koch, dottoranda del nostro gruppo. E la dottoressa Tamar Wissing, che è una ricercatrice post-dottorato del nostro laboratorio. Per montare l'impalcatura elettrofilata sul tubo in silicone, infilare una sutura in prolene 4-0 in un'estremità di un pezzo di tubo in silicone e fuori dall'altra.

Fai un piccolo nodo su entrambi i lati del tubo lasciando circa 10 centimetri di filo su entrambi i nodi e fai un terzo nodo sopra i due. Dopo aver rimosso un ago da sutura, tagliare i bordi del tubo di silicone in una forma triangolare e fare un nodo finale all'estremità dei due fili da 10 centimetri. Immergere l'impalcatura elettrofilata in etanolo al 30% e posizionare l'impalcatura su un'estremità del filo di sutura libero.

Successivamente, allunga delicatamente entrambi i lati del tubo in silicone e il nodo di sutura di 10 centimetri mentre il secondo ricercatore utilizza una pinzetta con una punta interna liscia per far scorrere delicatamente l'impalcatura elettrofilata sul tubo. Rilasciare lentamente l'allungamento sul tubo in silicone e contemporaneamente levigare l'impalcatura elettrofilata con le pinzette. E immergi l'impalcatura e il tubo in silicone in acqua ultra pura due volte.

Costruire lo scomparto inferiore e assicurarsi che l'O-ring sia posizionato correttamente. Posizionare una boccola dell'adattatore nella parte superiore dello scomparto inferiore e posizionare il condotto di pressione con i fori attraverso lo scomparto inferiore. Allacciare l'O-ring in silicone attorno all'estremità inferiore del condotto di pressione per evitare perdite.

E avvitare la parte inferiore dello scomparto inferiore alla parte superiore dello scomparto inferiore per fissare il condotto di pressione. Assicurarsi che la scanalatura inferiore incisa del condotto di pressione si trovi a circa tre-cinque millimetri sopra il bordo della boccola dell'adattatore dello scomparto inferiore. Tirare il tubo di silicone con l'impalcatura elettrofilata sopra il condotto di pressione e fare un cenno del capo e il filo di sutura all'estremità inferiore dell'impalcatura elettrofilata, nella posizione della scanalatura incisa sul condotto di pressione.

Fai un secondo cenno del capo sul lato opposto per fissare saldamente il tubo in silicone con l'innesto elettrofilato. E posizionando un morsetto a forbice dotato di una regola all'estremità superiore del tubo in silicone, tirare il morsetto a forbice verso l'alto in modo coerente e tirare delicatamente l'impalcatura elettrica per rimuovere eventuali rughe. Utilizzare un filo di sutura per fare due nodi su entrambe le estremità dell'impalcatura nella scanalatura superiore incisa del condotto di pressione.

Quando entrambi i nodi sono stati fatti, rilasciare il morsetto a forbice e utilizzare un coltello per rimuovere il tubo in silicone in eccesso. Avvitare i coni di punta sulla filettatura dei condotti di pressione per i campioni che verranno caricati dinamicamente. Immergere il condotto di pressione, il tubo e l'impalcatura una volta in etanolo al 30% e due volte in acqua ultrapura per pre-bagnare l'installazione.

Posizionare il tubo di vetro sopra il condotto di pressione e spingere delicatamente sullo scomparto inferiore per fissare il tubo di vetro in posizione. Quindi posizionare il raddrizzatore di flusso, un O-ring in silicone e la boccola dell'adattatore nello scomparto superiore. E fissare lo scomparto sopra l'estremità aperta del tubo di vetro.

Rimuovere il tappo dell'esca maschio dall'uscita del flusso, lavorare in una cappa a flusso laminare sterile. Aprire il tappo bianco dell'esca e posizionare un fazzoletto di etanolo davanti all'uscita del flusso. Decostruire la camera di coltura a flusso rimuovendo il tubo di vetro con lo scomparto superiore.

Posizionare un tubo da pascolo sottovuoto, aggiungerlo all'impalcatura elettrofilata per rimuovere quanto più terreno possibile. E aggiungere la soluzione di fibrinogeno in un rapporto uno a uno con la sospensione cellulare integrata con trombina. Pipettare la soluzione su e giù una volta e gocciolare immediatamente la soluzione su tutta la lunghezza dell'impalcatura.

Quando tutte le celle sono state consegnate, muovi lentamente l'impalcatura da sinistra a destra e su e giù per ottenere una distribuzione uniforme delle cellule. Quando entrambi i lati dell'impalcatura sono stati seminati, ricostruire attentamente la camera di coltura del flusso rimettendo il tubo di vetro e lo scomparto superiore. Posizionare la camera di coltura a flusso nell'incubatore per far solidificare la fibra.

Per accoppiare il bioreattore al sistema di pompaggio, posizionare la camera di coltura a flusso su una delle otto filettature sulla base del bioreattore. E posizionare una clip host sul tubo medio. Rimuovere il tappo bianco dell'esca, coprendo l'ingresso del flusso dello scomparto superiore della camera di coltura del flusso e rimuovere l'accoppiatore dell'esca femmina del tubo del mezzo.

Collegare il tubo del fluido con un lato dell'ingresso del flusso sullo scomparto superiore. E l'altro lato con l'uscita del flusso nello scomparto inferiore. Trasferire la configurazione completa dalla cabina a flusso laminare all'incubatore.

E collegare un'unità fluidica e la base del bioreattore al tubo della pressione dell'aria e al cavo elettrico. Avviare il software e inizializzare le pompe. Avviare il flusso del fluido per i campioni uno per uno.

Quindi modificare i parametri della pompa di deformazione sulle impostazioni desiderate e iniziare la deformazione. Monitorare l'allungamento applicato all'impalcatura a giorni alterni. Il monitoraggio delle sollecitazioni di stiramento e di taglio delle pareti per periodi di coltura a lungo termine mostra che questi valori possono essere mantenuti a livelli relativamente costanti per un periodo fino a 20 giorni.

Dopo tre giorni di carico emodinamico, la colorazione immunofluorescente rivela una distribuzione omogenea di macrofagi e miofibroblasti derivati dai monociti in tutto lo scaffold. Dopo 20 giorni di co-coltura, l'allungamento ciclico provoca la deposizione di fibre di collagene di tipo 1 più numerose e più spesse. Mentre nel gruppo di carico emodinamico combinato, l'effetto di allungamento ciclico è annullato dallo stress puro e proprio, con conseguente deposizione di collagene di tipo 1 meno pronunciata.

Dopo otto giorni di monocoltura dei macrofagi, l'erosione e la scissione delle fibre sono osservate in tutti i regimi di carico emodinamico con il riassorbimento più pronunciato osservato nel gruppo statico e il riassorbimento meno pronunciato osservato nel gruppo stress puro. Sia l'allungamento ciclico che lo stress puro e semplice influiscono sul profilo di secrezione delle citochine della configurazione di co-coltura. È interessante notare che gli effetti combinati di entrambi i carichi mostrano la dominanza di uno dei due carichi o gli effetti sinergici di entrambi i carichi.

Gli esperimenti di co-coltura mostrano anche che l'ambiente meccanico e gli ambienti infiammatori dipendenti dal carico modulano il fenotipo dei miofibroblasti. Inoltre, i modelli di espressione genica del marcatore contrattile alfa actina della muscolatura liscia sono correlati alla sintesi proteica. La cosa più importante quando si esegue questo protocollo è che è ciò che l'applicazione di stretch, è essenziale che la configurazione sia priva di perdite.