Iniezioni pupali e adulte per l'editing genico RNAi e CRISPR a Nasonia al vetripennis

La ricerca su modelli di insetti non canonici, come la vespa parassitoide, è limitata perché la microiniezione embrionale è molto impegnativa. Il nostro metodo aggira questo problema, consentendo mutazioni germinali sito-specifiche ed ereditabili. L'iniezione di pupe o femmine adulte è veloce ed elimina la necessità di attrezzature costose o di una formazione specializzata necessaria per ottenere microiniezioni embrionali di successo.

Questa tecnica non consentirà ai laboratori specializzati che non hanno accesso ad attrezzature costose di eseguire studi funzionali in qualsiasi specie di insetti che stanno utilizzando come modello. Dopo l'ottimizzazione, questo metodo può essere utilizzato per studiare la genetica funzionale di molti altri geni in Nasonia. Pensiamo anche che questo metodo possa essere utilizzato per fornire acidi nucleici per la trasformazione genetica di Nasonia o di altri insetti.

Inizia preparando circa 20 femmine accoppiate singolarmente in piccole provette di vetro tappate con cotone. Aggiungi due ostie di S.bullata per provetta e mantieni le vespe a 25 gradi Celsius e 30% di umidità relativa con un ciclo di buio chiaro 12:12 per due o tre giorni. Dopo due o tre giorni, rimuovere delicatamente le femmine usando una spazzola a punta fine per evitare una posizione eccessiva continua e una sincronia nello sviluppo della prole.

Le femmine rimosse possono essere riospitate o conservate a cinque gradi Celsius per un massimo di un mese. Mantenere l'ospite parassitato a 25 gradi Celsius e 30% di umidità relativa con un ciclo di buio chiaro 12:12 per sette giorni se la fase di iniezione desiderata richiede pupe bianche, per 13 giorni, se lo stadio di sviluppo richiesto è costituito da pupe nere, o 14 giorni per giovani adulti appena emersi. Quando viene raggiunto lo stadio desiderato, aprire il pupario ospite con un ago da dissezione per recuperare le pupe di N. vitripennis e gli adulti.

Prepara un vetrino applicando una linea di colla scolastica al centro. Stendere la colla con l'ago da dissezione fino ad ottenere uno strato spesso, che servirà per allineare le pupe. Lascia asciugare la colla per circa due minuti prima di trasferire le pupe.

Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare un ago da dissezione per applicare la colla sulla parte posteriore della testa della pupa. Attacca la pupa allo strato di colla sul vetrino con l'addome rivolto verso l'alto. Allineare da 20 a 30 pupe una accanto all'altra sul vetrino.

Posiziona il vetrino con le pupe e una capsula di Petri per far guidare la colla per circa 10 minuti. Prima di iniziare le iniezioni, testare l'aderenza delle pupe alla colla spingendole delicatamente con l'ago da dissezione. Se la maggior parte delle pupe si è allentata, preparare un nuovo vetrino.

In alternativa, rimuovere tutte le pupe sciolte e procedere all'iniezione di quelle che sono correttamente fissate al vetrino. Caricare un tubo di vetro capillare in un estrattore per aghi e tirare gli aghi seguendo le istruzioni del produttore. Caricare l'ago con cinque microlitri della miscela per iniezione preparata utilizzando i puntali delle pipette microloader.

Aprire l'ago, facendo scorrere la punta su una superficie formata da due slitte sovrapposte. In alternativa, apri la punta dell'ago con un paio di pinze sottili per creare un bordo affilato. Posizionare il vetrino con le pupe allineate sotto un microscopio da dissezione, quindi inserire l'ago nel tubo di iniezione del femtojet e serrare la testa dell'impugnatura.

Osservando l'ago al microscopio, accendere il femtogetto e impostare i parametri della pressione di compensazione e della pressione di iniezione ruotando le manopole. Inserire con cautela l'ago tra il secondo e il terzo segmento addominale visibile con un angolo verticale di circa 30 gradi. Iniettare con un flusso continuo fino a quando tutto l'addome diventa verde nel caso di pupe bianche allo stadio o fino a quando l'addome non aumenta di dimensioni nel caso di pupe nere.

Interrompere l'iniezione quando è chiaro che l'addome non può assorbire più liquidi o quando il liquido inizia a fuoriuscire dal corpo. Passa con cautela alla pupa successiva e ripeti questi passaggi. Trasferire il vetrino con le pupe iniettate in una capsula di Petri.

Coprite il piatto con il suo coperchio e mettetelo a 25 gradi Celsius fino all'emersione della vespa. Per la preparazione degli adulti, separare gruppi di 20 femmine vergini in una piccola provetta pulita con un pennello fine. Posizionare un vetrino sopra il ghiaccio e allineare la femmina fianco a fianco sul vetrino freddo con l'addome rivolto verso l'alto sotto un cannocchiale da dissezione.

Caricare un ago con la soluzione ribonucleoproteica utilizzando una punta di microcaricamento e inserire l'ago nella confezione del connettore del gruppo tubo aspiratore. Sostieni le femmine dal lato opposto con aghi da dissezione smussati, mentre inietti lentamente nell'addome. Evitare di toccare l'ovopositore.

Ciò danneggerà gravemente questa struttura riproduttiva critica. Inserire con cautela l'ago tra il secondo e il terzo segmento addominale visibile con un angolo verticale di circa 30 gradi. Iniettare la soluzione nell'addome femminile, fermandosi quando non può entrare più liquido o quando si osserva una fuoriuscita di soluzione in eccesso.

Passa con cautela alla femmina successiva e ripeti questi passaggi. Al termine, trasferire delicatamente una singola femmina iniettata in una nuova provetta con un ospite utilizzando un pennello. Lasciarli recuperare a temperatura ambiente per circa un'ora, confermare la sopravvivenza e rimettere i tubi nell'incubatrice di allevamento.

Dopo l'eclosione adulta dalle pupe iniettate, mettere le singole vespe in un bicchiere da tappare con cotone e inserire un ospite di S. bullata. Per gli esperimenti knockout CRISPR/Cas9, consentire alle femmine di parassitare l'ospite per un giorno e sostituire l'ospite ogni giorno per tre giorni consecutivi. Posizionare l'ospite parassitato, impostare a 25 gradi Celsius fino alla comparsa della prole maschile G0, circa 13-14 giorni.

Sotto un microscopio da dissezione, esaminare i maschi G0 per i fenotipi mutati. Il gene del cinabro è responsabile della pigmentazione degli occhi. Le vespe con gli occhi marroni sono di tipo selvatico e le vespe con gli occhi rosso vivo o le variazioni tra gli occhi rossi e marroni sono mutanti.

Questo protocollo può essere utilizzato per la microiniezione di pupe o adulti. I tassi di sopravvivenza di questa procedura variano dal 15 al 100% L'efficienza nel raggiungere il fenotipo desiderato tramite RNAi o CRISPR senza richiedere laboriose iniezioni di uova è mostrata qui. Quando si iniettano pupe o femmine adulte, l'ago deve essere affilato ed essere introdotto in modo che il liquido non fuoriesca immediatamente dopo l'iniezione.

Se ciò accade, rimuovere l'ago, assicurarsi che la punta sia fine e affilata, cambiarla se necessario o iniettarla in una posizione diversa. L'analisi della funzione può essere eseguita sul gene di interesse oggetto di questa procedura. Questo risponderà a una domanda sulla funzione del gene e se il gene è necessario per il fenotipo specifico studiato.