Name: Tecnica di iniezione di embrioni per lediting genetico nella zecca dalle zampe nere, Ixodes scapularis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Impara la tecnica di microiniezione di embrioni in Ixodes scapularis per l'editing genetico. Questo metodo innovativo permette di studiare la funzione genica e le interazioni con patogeni, contribuendo allo sviluppo di vaccini contro malattie trasmesse dalle zecche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori ringraziano Channa Aluvihare e Yonus Gebermicale, ITF, UMD, per la comprensione e il supporto durante la fase iniziale dello sviluppo del protocollo. Gli aghi di tungsteno sono stati un dono generoso di David O'Brochta, ITF, UMD. Siamo grati al Dr. Ladislav Simo per aver testato questo protocollo in I. ricinus e per le discussioni approfondite. Questo progetto è stato finanziato da NIH-NIAID R21AI128393 e Plymouth Hill Foundation, NY a MG-N, fondi di avvio dall'Università del Nevada ad AN, il National Science Foundation Grant No. 2019609 a MG-N e AN e una sovvenzione peer-to-peer da IGTRCN a AS.

Gli adulti di Ixodes scapularis sono stati acquistati dalla Oklahoma State University (OSU) o allevati presso l'Università del Nevada, Reno (UNR) (protocollo IACUC # 21-001-1118).
1. Preparazione di zecche femminili per la raccolta di embrioni
NOTA: Per raccogliere le uova di età appropriata, è importante sincronizzare la deposizione delle uova. Sebbene i segnali di deposizione delle uova nelle zecche rimangano poco chiari, nelle condizioni settarie standard (temperatura di 27 ° C e umidità relativa del >90% (RH)), le femmine di I. scapularis iniziano a deporre le uova circa 8 giorni dopo il distacco dell'ospite. Questa linea temporale può essere allungata immagazzinando femmine piene a 4 °C. Abbiamo conservato femmine alimentate con sangue a 4 °C fino a 8 settimane senza alcun effetto negativo sulla deposizione delle uova. Queste condizioni potrebbero dover essere modificate per ogni insettario.
<ol><li>Conservare tutte le femmine piene a 4 °C con >90% di umidità relativa in una scatola di plastica da 6 litri rivestita con carta da filtro umida fino a quando non vengono utilizzate per microiniezioni.</li>
	<li>Una settimana prima delle iniezioni, trasferire le femmine da 4 °C a un'incubatrice a 27 °C per l'inizio della deposizione delle uova.</li>
	<li>Quando le femmine iniziano a deporre le uova (3-4 giorni dopo averle spostate a 27 °C), rimuovere le uova con un pennello a punta fine e preparare le femmine per l'ablazione dell'organo di Gené (ghiandola di cera). NOTA: L'organo del Gené si estende dall'area tra lo scudo e il capitulum (base dorsale dell'apparato boccale), l'apparato boccale si piega sulla superficie ventrale del corpo (parallelo alla superficie) e l'organo esteso del gene ricopre le uova non appena le uova vengono deposte (Figura 1). Le uova deposte prima dell'asportazione dell'organo di Gené o dello svuotamento della cera avranno un rivestimento di cera e non sono adatte per le iniezioni e devono essere scartate.</li>
	<li>Per rimuovere o svuotare l'organo del Gené, utilizzare l'argilla per posizionare la femmina ingorgata su un vetrino al microscopio orientato in modo che l'apparato boccale sia visibile su entrambi i lati ventrale e dorsale (Figura 1B,C).<ol><li>Colpire con attenzione l'area esattamente tra lo scudo e l'apparato boccale usando pinze sottili e aghi di tungsteno realizzati in laboratorio utilizzando filo di tungsteno seguendo un protocollo16 precedentemente pubblicato (gli aghi possono anche essere acquistati in commercio e attaccati a una sonda di micro dissezione, vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Lavorando all'interno con l'ago di tungsteno, estrarre la ghiandola di cera (Figura 1D,E). Potrebbero essere necessari alcuni minuti per rimuovere la ghiandola. Pulire via la secrezione di cera liquida usando salviette da laboratorio. NOTA: La ghiandola può anche essere rimossa dal lato ventrale proprio sotto l'apparato boccale; raggiungendo nella parte posteriore verso lo scudo con ago e una pinza. L'applicazione di colla siliconica intorno all'apparato boccale blocca anche l'eversione dell'organo di Gene e può essere utilizzata al posto di rimuovere o svuotare la cera (comunicazione personale con il Dr. Ladislav Simo, INRAE, Francia). Le zecche ingorgate non rimarranno sul nastro biadesivo. L'uso dell'argilla per "fasciare" il segno di spunta aiuta a mantenerli in posizione durante la manipolazione. Utilizzare una pinza per tenere la zecca e l'ago di tungsteno per la dissezione. La parte ventrale è più facile da perforare con un ago e preferita dagli autori.</li>
	</ol></li>
	<li>Per svuotare la ghiandola, disporre il segno di spunta gravido come indicato nel passaggio 1.4. Forare con cura l'area dietro l'apparato boccale sul lato dorsale e applicare pressione sul lato ventrale usando una pinza. NOTA: In alternativa, non è necessario rimuovere la ghiandola di cera; Svuotare la ghiandola di cera durerà per diversi giorni. Le femmine che depongono le uova hanno un'area bianca intorno alle parti della bocca che indica la posizione della ghiandola di cera e può essere utilizzata come riferimento.<ol><li>Posizionare il bordo di una salvietta da laboratorio priva di lanugine e rimuovere la cera liquida che fuoriesce dal sito di puntura. Assicurarsi di evitare la secrezione di emolinfa, che è un liquido chiaro rispetto alla cera viscosa leggermente giallastra. Potrebbero essere necessari 5-10 minuti prima che la maggior parte della cera venga rimossa.</li>
	</ol></li>
	<li>Dopo la manipolazione, mettere le femmine in un'incubatrice a 27 ° C (>90% RH) e consentire loro di recuperare per 1-2 giorni. NOTA: Le femmine trattate di solito impiegano 1-2 giorni per recuperare e ricominciare a deporre le uova.</li>
	<li>Quando le femmine ricominciano a deporre le uova, usate un pennello fine per raccogliere le uova appena depositate (0-18 ore dopo la deposizione delle uova) e mettetele in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. NOTA: Se si utilizzano uova della stessa femmina nel tempo, questa procedura deve essere ripetuta dopo 4-5 giorni di deposizione delle uova se le ghiandole non sono state rimosse.</li>
</ol>2. Trattamento embrionale per microiniezioni
<ol><li>Aggiungere ~200 μL (o volume sufficiente per coprire le uova, a seconda del numero di uova) del 5% (peso/volume) di benzalconio cloruro/acqua (vedi tabella dei materiali) nel tubo contenente uova vecchie 0-18 ore. Ruotare delicatamente le uova con il pennello per 5 minuti per evitare che le uova si depositino sul fondo del tubo (per i dettagli, vedere Sharma et al.4). Rimuovere il surnatante usando una micropipetta, lasciando le uova nel tubo. ATTENZIONE: Il benzalconio cloruro è corrosivo per la pelle e gli occhi, indossare guanti e protezione per gli occhi.</li>
	<li>Aggiungere ~ 200 μL di acqua distillata (DI) al tubo contenente le uova, ruotare con un pennello e rimuovere l'acqua dal tubo della microcentrifuga usando una micropipetta. Ripetere il lavaggio con acqua DI ancora una volta.</li>
	<li>Dopo il lavaggio con acqua DI, aggiungere ~ 200 μL di cloruro di sodio (NaCl) al 5% (p/v) e agitare delicatamente con un pennello per 5 minuti. Rimuovere la soluzione dal tubo dopo 5 minuti e lavare le uova due volte con acqua DI.</li>
	<li>Aggiungere ~100 μL di soluzione di NaCl all'1% (p/v) nella provetta della microcentrifuga contenente le uova. Conservare le uova in una soluzione di NaCl all'1% (p/v) fino a quando non vengono utilizzate per le iniezioni.</li>
	<li>Inizia le microiniezioni dopo circa un'ora. Questa linea temporale aiuta nella corretta essiccazione delle uova e impedisce loro di scoppiare. NOTA: Le uova possono essere conservate in soluzione di NaCl all'1% (p/v) per 7-8 ore senza influire significativamente sulla sopravvivenza. Se le uova sono difficili da iniettare o scoppiare, le uova non sono abbastanza essiccate e possono essere ulteriormente trattate con NaCl al 5% (p/v) per altri 5 minuti.</li>
</ol>3. Preparazione degli aghi per iniezione
<ol><li>Inserire un vetro capillare alluminosilicato (con filamento, vedere Tabella dei materiali) nell'estrattore di aghi seguendo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Regolare l'estrattore dell'ago sulle seguenti impostazioni: Calore: 575, Tiro: 20, Velocità: 50, Tempo: 200 e Pressione: 700.</li>
	<li>Attivare la funzione di trazione dell'estrattore di aghi e ripetere il processo per altri aghi.</li>
	<li>Conservare gli aghi tirati infilandoli in linee di argilla del modellatore in una capsula di Petri pulita.</li>
	<li>Caricare l'ago con la miscela per iniezione utilizzando una punta di micro caricatore (vedere Tabella dei materiali). NOTA: Il confronto degli aghi utilizzati per l'iniezione di embrioni di zecche e zanzare è mostrato nella Figura 2.</li>
</ol>4. Configurazione del vetrino per le microiniezioni
<ol><li>Utilizzando del nastro biadesivo, far aderire due vetrini per microscopio di vetro insieme, lasciando uno spazio di circa 0,5 cm per sostenere l'allineamento delle uova e impedire loro di rotolare durante le iniezioni (Figura 3A).</li>
	<li>Applicare un pezzo di pellicola trasparente (vedi Tabella dei materiali) sul nastro biadesivo nello spazio tra le diapositive. Assicurarsi di allineare perfettamente la pellicola con lo spazio.</li>
</ol>5. Microiniezioni embrionali
<ol><li>Allineare 8-10 uova alla volta sulla configurazione della diapositiva (sopra) usando un pennello a pelo singolo. NOTA: Le uova allineate con l'asse perpendicolare più lungo (Figura 3B) al bordo di scorrimento sono più facili da iniettare rispetto alle uova il cui asse longitudinale è allineato parallelamente al bordo (Figura 3C). Le uova con orientamento perpendicolare (Figura 3B) possono resistere meglio all'iniezione, con conseguente maggiore sopravvivenza.</li>
	<li>Posizionare il vetrino con le uova allineate sul palco di un microscopio composto. Utilizzare un pezzo di salvietta priva di lanugine per rimuovere la soluzione di NaCl all'1% in cui sono conservati.</li>
	<li>Collegare l'ago per iniezione riempito a un microiniettore collegato a un micromanipolatore (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Aprire l'ago strofinando delicatamente contro la superficie dell'uovo utilizzando un'impostazione ad alta pressione sul microiniettore (>5.000 hPa).</li>
	<li>Dopo l'apertura dell'ago, ridurre la pressione (1.000-2.500 hPa) del microiniettore a seconda dell'apertura dell'ago. NOTA: un'apertura piccola richiederà una pressione relativamente più elevata, mentre un'apertura più grande richiederà una pressione inferiore. Questo per controllare il volume del costrutto iniettato. A seconda delle dimensioni dell'apertura dell'ago, il volume di iniezione varierà da 1 a 5 pL.</li>
	<li>Iniettare tutte le uova sul vetrino con un angolo di 10°-15° il più rapidamente possibile e spostare immediatamente il vetrino in condizioni di elevata umidità in una capsula di Petri rivestita con carta umida. Non appena le uova vengono iniettate, iniziano a essiccare. NOTA: L'iniezione di un piccolo numero di uova alla volta aumenta il successo dell'iniezione e la probabilità di sopravvivenza. Gli aghi si ostruiscono a causa del reflusso embrionale. Se la punta è ancora affilata, per eliminare gli aghi ostruiti, spostare l'ago in una piccola goccia di NaCl all'1% aggiunta al bordo del vetrino. L'azione capillare rimuoverà il piccolo intasamento. Se l'ago è già smussato, cambialo.</li>
</ol>6. Cura post-iniezione degli embrioni
<ol><li>Posizionare il vetrino contenente gli embrioni iniettati in una grande capsula di Petri rivestita con carta da filtro umida. NOTA: È fondamentale non disturbare le uova per almeno 5-6 ore. Ciò consente alla ferita da iniezione di sigillarsi correttamente. La ferita da iniezione può aprirsi quando agitata e il citoplasma può iniziare a trasudare, con conseguente mortalità delle uova.</li>
	<li>Dopo 5-6 ore, aggiungere una piccola goccia di acqua DI alla medicazione trasparente con embrioni iniettati attaccati. Usando un pennello, spostare delicatamente le uova. Trasferire le uova in una piccola capsula di Petri (10 cm) e immergerle in acqua DI. NOTA: La medicazione del film consente una facile rimozione delle uova dopo le iniezioni. Nel momento in cui una goccia d'acqua viene aggiunta alla medicazione del film, le uova inizieranno a muoversi insieme all'acqua.</li>
	<li>Tenere le uova immerse in acqua e mettere la capsula di Petri in una scatola di plastica da 6 litri in un'incubatrice a 27 °C e >90% RH.</li>
	<li>Controlla le uova regolarmente, ogni giorno per i primi giorni, e poi ogni 3-4 giorni fino a quando le larve iniziano a schiudersi. NOTA: Se un gran numero di uova viene danneggiato durante le microiniezioni, drenare delicatamente l'acqua DI dopo una settimana impedirà la crescita fungina sulle uova morte.</li>
	<li>Quando le larve iniziano a schiudersi dagli embrioni iniettati (21-25 giorni dopo l'iniezione per l'attuale configurazione di laboratorio), controllarle quotidianamente e trasferire eventuali larve tratteggiate in fiale di vetro con uno schermo in cima. Le larve possono schiudersi sott'acqua e sopravvivere per ~ 1-2 settimane.</li>
	<li>Schermare le larve4 se le uova sono state iniettate con un costrutto che può risultare in un fenotipo visibile.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).</li>
	<li>Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).</li>
	<li>Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).</li>
	<li>Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).</li>
	<li>Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).</li>
	<li>Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).</li>
	<li>Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).</li>
	<li>Criscione, F., O&#39;Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).</li>
	<li>Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).</li>
	<li>Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).</li>
	<li>Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).</li>
	<li>Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).</li>
	<li>Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene&#39;s organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).</li>
	<li>Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).</li>
	<li>Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gen&#233;&#39;s) organ in ixodid ticks. Tissue &#38; Cell. 21 (1), 113-122 (1989).</li>
	<li>Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental &#38; Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).</li>
	<li>Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo è il primo protocollo sviluppato per iniettare con successo embrioni di zecca precoci. È stato raggiunto un tasso di sopravvivenza di ~ 4% -8%, che è paragonabile all'iniezione di embrioni in altri modelli di insetti ben consolidati5.
Poiché questo è il protocollo iniziale, si prevede che questo protocollo sarà ulteriormente perfezionato e specializzato per le singole specie di zecche. In particolare, i tempi di iniezione varieranno da specie a specie, a seconda ...

Le zecche sono vettori di importanza medica e veterinaria, in grado di trasmettere una varietà di patogeni virali, batterici, protozoari e nematodi 1,2. Negli Stati Uniti orientali, la zecca dalle zampe nere, Ixodes scapularis, è un importante vettore del patogeno della malattia di Lyme (LD), la spirocheta Borrelia burgdorferi. Oltre 400.000 casi di LD sono segnalati ogni anno negli Stati Uniti, rendendola la principale malattia infettiva trasmessa da vettori negli Stati Uniti1. Oltre a B. burgdorferi, altri sei microrganismi sono trasmessi da I. scapularis, tra cui quattro batteri (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi e Ehrlichia muris eauclarensis), un protozoo parassita (Babesia microti) e un virus (Powassan virus), rendendo questa specie di zecche un importante problema di salute pubblica3 . Mentre le malattie trasmesse dalle zecche sono diventate più diffuse negli ultimi anni, la ricerca sulle zecche è rimasta indietro rispetto ad altri vettori di artropodi, come le zanzare, a causa della biologia unica delle zecche e delle sfide associate all'applicazione di strumenti genomici genetici e funzionali 4,5.
Le tecniche di modifica genetica, in particolare CRISPR / Cas9, hanno ora reso fattibili studi di genomica funzionale in organismi non modello. Per creare mutazioni ereditabili in un organismo, l'iniezione di embrioni rimane il metodo preferito per fornire costrutti per alterare la linea germinale 6,7,8,9. Tuttavia, fino a poco tempo fa4, le uova di zecca erano considerate troppo difficili o addirittura impossibili da iniettare senza uccidere l'embrione10,11. Uno spesso strato di cera sulle uova, corion duro e alta pressione intraovale erano alcuni dei principali ostacoli che impedivano l'iniezione di embrioni nelle zecche. Gli adulti, alimentati con sangue I. scapularis depositano una singola frizione fino a 2.000 uova12 in 3-4 settimane (circa 100 uova / giorno). Le uova vengono deposte singolarmente e ogni uovo è ricoperto di cera secreta da sporgenze o "corna" dell'organo ghiandolare di Gené13,14,15 della madre. Questa cera protegge le uova dall'essiccazione e contiene composti antimicrobici15. Per iniettare con successo le uova di zecca, è importante rimuovere lo strato di cera, ammorbidire il corion e asciugare le uova per ridurre la pressione intraovale in modo che l'iniezione non danneggi irreversibilmente l'uovo. Comprendendo l'importanza critica delle iniezioni embrionali per il successo della trasformazione germinale, viene sviluppato un protocollo per I. scapularis, che può essere utilizzato per fornire un costrutto CRISPR / Cas9 e generare mutazioni germinali stabili4. Oltre al suo contributo alla ricerca su I. scapularis, questo protocollo potrebbe anche essere ottimizzato per altre specie di zecche.

<table><tbody><tr><td>Capillari in silicato di alluminio, con filamento</td><td>Strumenti Sutter</td><td>AF100-64-10</td><td>Iniezione di embrioni</td></tr><tr><td>Cloruro di benzalconio 50% in acqua, 25 g</td><td>TCI-America</td><td>B0414</td><td>Trattamento embrionale, 25 g è circa 25 mL</td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>Cura post-iniezione</td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Thomas Scientific</td><td>300-101</td><td>Organo del gene manipolazione</td></tr><tr><td>Salviette da laboratorio</td><td>Genesee Scientific</td><td>88-115</td><td></td></tr><tr><td>Punte per microloader</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Caricamento degli aghi tirati</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Strumenti Sutter</td><td>ROE-200</td><td>Iniezione di embrioni</td></tr><tr><td>Vetrini microscopici - bordi lisci e rettificati</td><td>Genesee Scientific</td><td>29-100</td><td>Allineamento dell'embrione, i bordi rettificati sono preferibili, i bordi smussati potrebbero oscurare le uova dalla vista</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International</td><td>S23020-500.0</td><td>Trattamento degli embrioni</td></tr><tr><td>Needle Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Nastro biadesivo permanente</td><td>Scotch</td><td>34-8716-3417-5</td><td>Allineamento degli embrioni</td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-107G</td><td>Cura post-iniezione</td></tr><tr><td>Tegaderm/ Trasparente rivestimento in pellicola</td><td>3M Healthcare</td><td>1628</td><td>Allineamento degli embrioni Aghi</td></tr><tr><td>di tungsteno</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>10130-10</td><td>Manipolazione degli organi dei geni</td></tr><tr><td>Filo di tungsteno</td><td>Amazon</td><td>B08DNT7ZK3</td><td>Manipolazione degli organi dei geni</td></tr><tr><td>Microiniettore digitale XenoWorks</td> Strumenti <td>Sutter</td><td>MPC-200</td><td>Iniezione di embrioni</td></tr></tbody></table>

tecnica di iniezione di embrioni per l'editing genetico nella zecca dalle zampe nere, ixodes scapularis

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Le zecche possono trasmettere vari patogeni virali, batterici e protozoari e sono quindi considerate vettori di importanza medica e veterinaria. Nonostante il crescente onere delle malattie trasmesse dalle zecche, la ricerca sulle zecche è rimasta indietro rispetto ai vettori di malattie degli insetti a causa delle sfide nell'applicazione di strumenti di trasformazione genetica per studi funzionali alla biologia unica delle zecche. Gli interventi genetici hanno guadagnato attenzione per ridurre le malattie trasmesse dalle zanzare. Tuttavia, lo sviluppo di tali interventi richiede una trasformazione germinale stabile mediante iniezione di embrioni. Tale tecnica di iniezione di embrioni è carente per i chelicerati, comprese le zecche. Diversi fattori, come uno spesso strato di cera esterno sugli embrioni di zecche, corion duro e alta pressione intraovale, sono alcuni ostacoli che in precedenza impedivano lo sviluppo del protocollo di iniezione embrionale nelle zecche. Il presente lavoro ha superato questi ostacoli e qui è descritta una tecnica di iniezione di embrioni per la zecca dalle zampe nere, Ixodes scapularis.  Questa tecnica può essere utilizzata per fornire componenti, come CRISPR / Cas9, per trasformazioni germinali stabili.

Un protocollo di iniezione embrionale di successo per I. scapularis è descritto in questo articolo. Le femmine che depongono le uova sono state mantenute ad alta umidità per evitare l'essiccazione delle uova parzialmente cerate. Lo strato di cera è stato rimosso per iniettare embrioni di zecca ablando l'organo del gene (ghiandola di cera) della femmina gravida (Figura 1A-E). Abbiamo usato aghi di vetro alluminosilicati con un collo più corto (<stron...

Il presente protocollo descrive un metodo per iniettare embrioni di zecca. L'iniezione di embrioni è la tecnica preferita per la manipolazione genetica per generare linee transgeniche.

Tecnica di iniezione di embrioni per l'editing genetico nella zecca dalle zampe nere, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Questo è il primo protocollo di iniezione di embrioni per una specie di Chelicerata. La capacità di iniettare embrioni di zecca aprirà molte linee di ricerca, in particolare studi sulla funzione del gene delle zecche e sulle interazioni tra patogeni di zecche. Questa tecnica consente di lavorare in futuro su studi funzionali dei geni delle zecche e fornisce una base per il controllo della popolazione di zecche utilizzando sistemi di gene drive.Questo metodo faciliterà la comprensione dell'interazione tra le zecche e i patogeni che ospitano a livello molecolare. Questo ci permetterà di identificare le proteine che possono essere utilizzate per lo sviluppo di vaccini per la malattia di Lyme e altri agenti patogeni. Mentre diverse aree di ricerca come le interazioni dei patogeni delle zecche e la trasmissione dei patogeni agli ospiti da parte delle zecche durante l'alimentazione trarranno beneficio da questo lavoro.Domande più fondamentali come come le zecche eludono la risposta immunitaria dell'ospite e le differenze nei meccanismi di riparazione del DNA possono anche essere comprese ora. Ci sono alcuni aspetti della biologia delle zecche che devono essere compresi prima di eseguire questa procedura. L'alta pressione interna dell'embrione porta allo scoppio quando viene toccato da un ago.È molto importante preparare gli embrioni per l'iniezione. Per iniziare, trasferire le femmine da quattro gradi Celsius a un'incubatrice di 27 gradi Celsius per l'inizio della deposizione delle uova una settimana prima delle iniezioni. Dopo tre o quattro giorni quando le femmine iniziano a deporre le uova, rimuovere le uova usando un pennello a punta fine mentre si preparano le femmine per l'ablazione dell'organo di Gene.Per svuotare la ghiandola, disporre il segno di spunta gravido su un vetrino al microscopio in modo che le parti della bocca siano visibili su entrambi i lati ventrale e dorsale. Quindi perforare accuratamente l'area dietro le parti della bocca sul lato dorsale e applicare pressione sul lato ventrale usando una pinza. Posizionare il bordo di una salvietta priva di lanugine e rimuovere la cera liquida che fuoriesce dal sito di puntura.In alternativa, invece di svuotare la ghiandola mediante dissezione, è possibile utilizzare colle come l'adesivo tissutale intorno alle parti della bocca della zecca. Quando le femmine iniziano a deporre di nuovo le uova, utilizzare un pennello fine per raccogliere le uova appena depositate e metterle in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere circa 200 microlitri di acqua al 5% di benzalconio cloruro nel tubo contenente uova da zero a 18 ore.Ruotare delicatamente le uova con il pennello per cinque minuti per evitare che le uova si depositino sul fondo del tubo e rimuovere il surnatante usando una micro pipetta, lasciando le uova nel tubo. Aggiungere circa 200 microlitri di acqua distillata al tubo contenente le uova. Agitare con un pennello e rimuovere l'acqua dal tubo della microcentrifuga usando una micro pipetta.Dopo il lavaggio con acqua distillata, aggiungere circa 200 microlitri di cloruro di sodio al 5% e ruotare delicatamente con un pennello per cinque minuti. Quindi, rimuovere la soluzione dal tubo dopo cinque minuti e lavare le uova due volte con acqua distillata. Quindi, aggiungere circa 100 microlitri di soluzione di cloruro di sodio all'1% nella provetta da microcentrifuga contenente uova.In primo luogo, far aderire due vetrini da microscopio di vetro insieme, lasciando uno spazio di circa 0,5 centimetri per supportare l'allineamento delle uova usando un nastro biadesivo, e applicare un pezzo di pellicola trasparente sul nastro biadesivo nello spazio tra i vetrini. Quindi allineare da otto a 10 uova alla volta sulla configurazione della diapositiva usando un pennello. Quindi posizionare il vetrino con le uova allineate sul palco di un microscopio composto e rimuovere la soluzione di cloruro di sodio all'1% usando un pezzo di salvietta priva di lanugine in cui sono conservati.Collegare l'ago per iniezione riempito a un microiniettore collegato a un micromanipolatore. Quindi, aprire l'ago strofinando delicatamente contro la superficie dell'uovo utilizzando un'impostazione ad alta pressione sul microiniettore. Dopo aver aperto l'ago, ridurre la pressione del microiniettore a seconda dell'apertura dell'ago.Quindi iniettare tutte le uova sul vetrino con un angolo da 10 a 15 gradi il più rapidamente possibile, premere rapidamente il pedale e spostare immediatamente il vetrino in condizioni di elevata umidità in una capsula di Petri con un tovagliolo di carta umido. Dopo cinque-sei ore dal posizionamento del vetrino contenente embrioni iniettati in una grande capsula di Petri rivestita con carta da filtro umida, aggiungere una piccola goccia di acqua distillata alla medicazione trasparente con gli embrioni iniettati attaccati. Quindi, spostare delicatamente le uova usando un pennello.Quindi, trasferire le uova in una piccola piastra di Petri e immergerle in acqua distillata. Tenere le uova immerse in acqua, posizionare la capsula di Petri in una scatola di plastica da sei quarti in un'incubatrice a 27 gradi Celsius a più del 90% di umidità relativa. Quando la larva inizia a schiudersi dagli embrioni iniettati da 21 a 25 giorni dopo l'iniezione, controllarli quotidianamente e trasferire eventuali larve tratteggiate in fiale di vetro con uno schermo in cima.I risultati hanno dimostrato che iniettare le uova all'inizio dell'embriogenesi da 12 a 18 ore e allineare l'asse più lungo dell'uovo perpendicolarmente al bordo del vetrino si traduce in un più alto tasso di sopravvivenza delle uova iniettate. Di tutte le uova iniettate, fino all'8,5% è sopravvissuto e la larva si è schiusa. Prima di iniziare questa procedura, è importante ricordare i passaggi 2.4, rimozione della cera dalla zecca madre e passaggi da 3.1 a 3.4, ammorbidimento del corion dell'embrione con benzalconio cloruro e essiccazione dell'embrione con soluzioni di cloruro di sodio per consentire un'iniezione embrionale di successo.Questo metodo è stato sviluppato principalmente per l'editing del gene delle zecche e questo ci permetterà di fare knockout e knock-in che ci aiuteranno a capire la funzione del gene delle zecche. Questa tecnica consentirà l'uso di strumenti di modifica genetica disponibili per molti altri organismi da applicare alla ricerca sulle zecche. E questo accelererà la ricerca sulla biologia molecolare delle zecche.

embryo-injection-technique-for-gene-editing-black-legged-tick-ixodes

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

In questo video, Nijole Jasinskiene dimostra la metodologia utilizzata per generare transgenici zanzare Aedes aegypti, che sono vettori per la febbre dengue. Le tecniche per la corretta preparazione di aghi microiniezione, disidratanti embrioni, e l'esecuzione di microiniezione sono dimostrati.

Microiniezione di A. aegypti embrioni per ottenere zanzare transgeniche

In questo video, dimostriamo la consegna del costrutto gene drive nell'embrione della zanzara Anopheles gambiae attraverso la tecnica della microiniezione embrionale. Questa procedura consente l'integrazione del costrutto di DNA consegnato, attraverso la ricombinazione omologa, nelle cellule germinali per generare una popolazione di zanzare trasformata.

Microiniezione di embrioni di zanzara: una tecnica per fornire DNA esogeno nel tuorlo embrionale di Anopheles gambiae per generare mutazioni germinali

La mosca mediterranea della frutta (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) è un parassita dell'agricoltura mondiale. Una comprensione più profonda della sua biologia è fondamentale per controllare le popolazioni di mosche e quindi ridurre l'impatto economico. La microiniezione di embrioni è uno strumento fondamentale che consente sia la trasformazione della linea germinale che gli studi di genetica inversa in questa specie.

Consegna degli acidi nucleici attraverso Embrione microiniezione in tutto il mondo agricolo parassita,<em&gt; Capitata Ceratitis</em

La produzione di zecche allevate in laboratorio sano è essenziale per gli studi di biologia tick, tick e-patogeno interazioni. Qui mostriamo un semplice protocollo per l'alimentazione tick immaturo che è costo-efficace e meno stressante per i topi.

impennata<em&gt; Ixodes scapularis,</em&gt; Il Tick Black-legged: Alimentazione stadi immaturi sui topi

Microiniezione di embrioni Nasonia vitripennis è un metodo essenziale per la generazione di modifiche del genoma ereditabile. Una procedura dettagliata per microiniezione e il trapianto di embrioni Nasonia vitripennis , che agevolerà notevolmente la manipolazione del genoma futuri in questo organismo è descritto qui.

Microinjection di embrione e tecnica di trapianto per la manipolazione del genoma di Nasonia vitripennis

Qui presentiamo un protocollo per iniettare uova di cricket, una tecnica che serve come metodo fondamentale in molti esperimenti nel cricket, tra cui, ma non solo, l'interferenza dell'RNA e la manipolazione genomica.

Iniezione di uova di Gryllus bimaculatus

Questo protocollo descrive le procedure di microiniezione per gli embrioni di Culex quinquefasciatus ottimizzate per funzionare con gli strumenti di editing genetico CRISPR/Cas9. Questa tecnica può generare in modo efficiente mutazioni germinali site-specific, ereditabili, che possono essere utilizzate per costruire tecnologie genetiche in questo vettore di malattia poco studiato.

Tecniche di microiniezione embrionale per un'efficiente mutagenesi sito-specifica in Culex quinquefasciatus

Forniamo un protocollo dettagliato per l'allevamento, la microiniezione delle uova e per l'accoppiamento efficiente del firebrat Thermobia domestica per generare e mantenere ceppi mutanti dopo l'editing del genoma.

Microiniezione delle uova e accoppiamento efficiente per l'editing genomico nella Termbia domestica Firebrat

Molte caratteristiche dell'eusocialità degli insetti si basano sulla comunicazione all'interno della colonia e sulla divisione del lavoro. La manipolazione genetica dei geni regolatori chiave negli embrioni di formiche tramite microiniezione e mutagenesi mediata da CRISPR fornisce informazioni sulla natura del comportamento altruistico negli insetti eusociali.

Iniezioni di embrioni per mutagenesi mediata da CRISPR nel saltatore di Ant Harpegnathos

L'obiettivo generale di questo articolo è quello di descrivere come eseguire l'iniezione intracellulare ovo di materiali esogeni in embrioni di pollo. Questo approccio è molto utile per studiare la biologia dello sviluppo degli embrioni di pollo.

In zona Ovo Iniezione intravascolare in embrioni di pollo

Impara la tecnica di microiniezione di embrioni in Ixodes scapularis per l'editing genetico. Questo metodo innovativo permette di studiare la funzione genica e le interazioni con patogeni, contribuendo allo sviluppo di vaccini contro malattie trasmesse dalle zecche.

Tecnica di iniezione di embrioni per l'editing genetico nella zecca dalle zampe nere, Ixodes scapularis

Esplora altri video