Tecnica di iniezione di embrioni per l'editing genetico nella zecca dalle zampe nere, Ixodes scapularis

Il presente protocollo descrive un metodo per iniettare embrioni di zecca. L'iniezione di embrioni è la tecnica preferita per la manipolazione genetica per generare linee transgeniche.

Questo è il primo protocollo di iniezione di embrioni per una specie di Chelicerata. La capacità di iniettare embrioni di zecca aprirà molte linee di ricerca, in particolare studi sulla funzione del gene delle zecche e sulle interazioni tra patogeni di zecche. Questa tecnica consente di lavorare in futuro su studi funzionali dei geni delle zecche e fornisce una base per il controllo della popolazione di zecche utilizzando sistemi di gene drive.

Questo metodo faciliterà la comprensione dell'interazione tra le zecche e i patogeni che ospitano a livello molecolare. Questo ci permetterà di identificare le proteine che possono essere utilizzate per lo sviluppo di vaccini per la malattia di Lyme e altri agenti patogeni. Mentre diverse aree di ricerca come le interazioni dei patogeni delle zecche e la trasmissione dei patogeni agli ospiti da parte delle zecche durante l'alimentazione trarranno beneficio da questo lavoro.

Domande più fondamentali come come le zecche eludono la risposta immunitaria dell'ospite e le differenze nei meccanismi di riparazione del DNA possono anche essere comprese ora. Ci sono alcuni aspetti della biologia delle zecche che devono essere compresi prima di eseguire questa procedura. L'alta pressione interna dell'embrione porta allo scoppio quando viene toccato da un ago.

È molto importante preparare gli embrioni per l'iniezione. Per iniziare, trasferire le femmine da quattro gradi Celsius a un'incubatrice di 27 gradi Celsius per l'inizio della deposizione delle uova una settimana prima delle iniezioni. Dopo tre o quattro giorni quando le femmine iniziano a deporre le uova, rimuovere le uova usando un pennello a punta fine mentre si preparano le femmine per l'ablazione dell'organo di Gene.

Per svuotare la ghiandola, disporre il segno di spunta gravido su un vetrino al microscopio in modo che le parti della bocca siano visibili su entrambi i lati ventrale e dorsale. Quindi perforare accuratamente l'area dietro le parti della bocca sul lato dorsale e applicare pressione sul lato ventrale usando una pinza. Posizionare il bordo di una salvietta priva di lanugine e rimuovere la cera liquida che fuoriesce dal sito di puntura.

In alternativa, invece di svuotare la ghiandola mediante dissezione, è possibile utilizzare colle come l'adesivo tissutale intorno alle parti della bocca della zecca. Quando le femmine iniziano a deporre di nuovo le uova, utilizzare un pennello fine per raccogliere le uova appena depositate e metterle in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere circa 200 microlitri di acqua al 5% di benzalconio cloruro nel tubo contenente uova da zero a 18 ore.

Ruotare delicatamente le uova con il pennello per cinque minuti per evitare che le uova si depositino sul fondo del tubo e rimuovere il surnatante usando una micro pipetta, lasciando le uova nel tubo. Aggiungere circa 200 microlitri di acqua distillata al tubo contenente le uova. Agitare con un pennello e rimuovere l'acqua dal tubo della microcentrifuga usando una micro pipetta.

Dopo il lavaggio con acqua distillata, aggiungere circa 200 microlitri di cloruro di sodio al 5% e ruotare delicatamente con un pennello per cinque minuti. Quindi, rimuovere la soluzione dal tubo dopo cinque minuti e lavare le uova due volte con acqua distillata. Quindi, aggiungere circa 100 microlitri di soluzione di cloruro di sodio all'1% nella provetta da microcentrifuga contenente uova.

In primo luogo, far aderire due vetrini da microscopio di vetro insieme, lasciando uno spazio di circa 0,5 centimetri per supportare l'allineamento delle uova usando un nastro biadesivo, e applicare un pezzo di pellicola trasparente sul nastro biadesivo nello spazio tra i vetrini. Quindi allineare da otto a 10 uova alla volta sulla configurazione della diapositiva usando un pennello. Quindi posizionare il vetrino con le uova allineate sul palco di un microscopio composto e rimuovere la soluzione di cloruro di sodio all'1% usando un pezzo di salvietta priva di lanugine in cui sono conservati.

Collegare l'ago per iniezione riempito a un microiniettore collegato a un micromanipolatore. Quindi, aprire l'ago strofinando delicatamente contro la superficie dell'uovo utilizzando un'impostazione ad alta pressione sul microiniettore. Dopo aver aperto l'ago, ridurre la pressione del microiniettore a seconda dell'apertura dell'ago.

Quindi iniettare tutte le uova sul vetrino con un angolo da 10 a 15 gradi il più rapidamente possibile, premere rapidamente il pedale e spostare immediatamente il vetrino in condizioni di elevata umidità in una capsula di Petri con un tovagliolo di carta umido. Dopo cinque-sei ore dal posizionamento del vetrino contenente embrioni iniettati in una grande capsula di Petri rivestita con carta da filtro umida, aggiungere una piccola goccia di acqua distillata alla medicazione trasparente con gli embrioni iniettati attaccati. Quindi, spostare delicatamente le uova usando un pennello.

Quindi, trasferire le uova in una piccola piastra di Petri e immergerle in acqua distillata. Tenere le uova immerse in acqua, posizionare la capsula di Petri in una scatola di plastica da sei quarti in un'incubatrice a 27 gradi Celsius a più del 90% di umidità relativa. Quando la larva inizia a schiudersi dagli embrioni iniettati da 21 a 25 giorni dopo l'iniezione, controllarli quotidianamente e trasferire eventuali larve tratteggiate in fiale di vetro con uno schermo in cima.

I risultati hanno dimostrato che iniettare le uova all'inizio dell'embriogenesi da 12 a 18 ore e allineare l'asse più lungo dell'uovo perpendicolarmente al bordo del vetrino si traduce in un più alto tasso di sopravvivenza delle uova iniettate. Di tutte le uova iniettate, fino all'8,5% è sopravvissuto e la larva si è schiusa. Prima di iniziare questa procedura, è importante ricordare i passaggi 2.4, rimozione della cera dalla zecca madre e passaggi da 3.1 a 3.4, ammorbidimento del corion dell'embrione con benzalconio cloruro e essiccazione dell'embrione con soluzioni di cloruro di sodio per consentire un'iniezione embrionale di successo.

Questo metodo è stato sviluppato principalmente per l'editing del gene delle zecche e questo ci permetterà di fare knockout e knock-in che ci aiuteranno a capire la funzione del gene delle zecche. Questa tecnica consentirà l'uso di strumenti di modifica genetica disponibili per molti altri organismi da applicare alla ricerca sulle zecche. E questo accelererà la ricerca sulla biologia molecolare delle zecche.