Cattura di composti organici volatili microbici prodotti attivamente da campioni associati all'uomo con estrazione assorbente assistita da vuoto

Questo protocollo ci consente di concentrare e identificare facilmente metaboliti volatili e sostanze volatili prodotte attivamente da organismi microbici in una varietà di campioni biologici. VASE è un metodo più user-friendly per concentrare volatili a bassa abbondanza. Tutto ciò di cui hai bisogno è un campione sotto quasi vuoto e lascia che la fisica faccia il resto.

L'accesso all'analisi volatile di campioni clinici ha importanti implicazioni per la scoperta di biomarcatori metabolici in una serie di diversi stati patologici. Ad esempio, la guida e l'infezione dell'agente patogeno o il successo della terapia antibatterica potrebbero essere rilevati con l'analisi volatile di saliva, espettorato o campioni di respiro. Per preparare campioni fecali, aggiungere un millilitro di acqua deionizzata a 100 milligrammi di feci in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri e vortice per tre minuti.

Conservare i campioni su ghiaccio quando non in uso. Aggiungere 485 millilitri di mezzo BHI con glucosio 13C 20 millimolare o BHI con deuterio al 30% a 15 microlitri di miscela fecale e acqua, assicurando che il volume finale del campione sia di 500 microlitri. Preparare campioni in triplicati tecnici.

Per preparare i campioni di acque reflue, aggiungere 500 microlitri di acque reflue a 500 microlitri di mezzo BHI con glucosio 13C o deuterio al 30% per un volume totale di un millilitro. Preparare i campioni in triplice copia e tenerli sul ghiaccio. Per preparare i campioni di saliva, aggiungere 50 microlitri di saliva a 500 microlitri di mezzo BHI con glucosio 13C o deuterio al 30% per un volume totale di 550 microlitri.

Preparare i campioni in triplice copia e tenerli sul ghiaccio. Per preparare campioni di espettorato, aggiungere 15 microlitri di espettorato in un flaconcino. Preparare i campioni in triplice copia e tenerli sul ghiaccio.

Posizionare i flaconcini VOA vuoti sulla piastra fredda e posizionare la piastra fredda sul ghiaccio nella cappa di biosicurezza. Accendere il 5600 SPEU e regolarlo alla temperatura richiesta. Etichettare i flaconcini di VOA da 20 millilitri in base a campioni, repliche e ID HSP utilizzando un marcatore resistente all'acqua che resiste all'acqua nel caso in cui si formi condensa all'esterno del flaconcino mentre si è sul ghiaccio.

All'interno della cappa di biosicurezza, svitare il cappuccio bianco sulla fiala, inserire rapidamente il campione di pipetta nel flaconcino e assemblare il coperchio, il cappuccio nero e l'HSP. Riposizionare il flaconcino contenente il campione e l'HSP sulla piastra fredda. Una volta che tutti i campioni sono stati preparati nei flaconcini di vetro, accendere la pompa per vuoto, posizionare i flaconcini sotto vuoto e rimuovere la fonte di vuoto.

Ricontrollare la pressione dopo aver posto tutti i campioni sotto vuoto utilizzando il manometro. Se un flaconcino perde, assicurarsi che il cappuccio sia avvitato saldamente e che gli O-ring bianchi dell'HSP e le fodere del coperchio siano correttamente in posizione. Posizionare i flaconcini nello SPEU per il tempo e la temperatura ottimizzati con agitazione a 200 RPM.

Estrarre colture per un'ora a 70 gradi Celsius ed estrarre esperimenti di indagine dell'isotipo stabile con campioni fecali, fognari, saliva ed espettorato per 18 ore a 37 gradi Celsius. Posizionare la piastra fredda a meno 80 gradi Celsius per l'uso dopo il periodo di estrazione. Al termine dell'estrazione, posizionare i campioni sulla piastra fredda per 15 minuti per estrarre il vapore acqueo dall'HSP e dallo spazio di testa del flaconcino, quindi trasferire gli HSP nelle loro maniche.

Impostare la sequenza di campioni sul software Entech. Apri il programma e seleziona 5800 e Sequenza nelle opzioni a destra del menu a discesa Strumento. Salvate la tabella delle sequenze, selezionate Esegui sul lato sinistro, quindi Inizia con vuoto in Desorber se l'HSP vuoto non è il desorbitore.

Si noti che gli HSP verranno gestiti dall'SPR per ogni campione nella sequenza. Lasciare che l'SPR si riscaldi. Consentire all'SPR di eseguire automaticamente tutti i campioni.

La sequenza sul lato GC-MS registrerà automaticamente i dati in file separati. Aggiungere un picco al metodo di elaborazione selezionando Calibra seguito da Modifica composto, Nome e Inserisci composto in Composto standard esterno. Aggiungere il nome dei composti, il tempo di ritenzione e lo ione bersaglio del segnale quantitativo.

Aggiungi i tre picchi più grandi, che includono composti con una probabilità superiore al 75%, assicurando che l'allineamento di ogni ione identificativo del composto si trovi all'interno del centro del picco. Salvarlo selezionando OK, quindi Metodo e Salva. Una volta impostato il metodo di processo, procedere a Quantitate e Calculate, quindi View e QEDIT Quant Result per quantificare i dati.

Qui, l'estrazione assorbente assistita da vuoto è stata seguita dal desorbimento termico su un GC-MS per esaminare i profili volatili delle mono-e-co-colture batteriche e identificare i volatili prodotti attivamente con un sondaggio isotopico stabile da feci umane, saliva, liquami e campioni di espettorato. Le mono-e co-colture consistevano nelle specie batteriche staphylococcus aureus, pseudomonas aeruginosa e acinetobacter baumannii. 43 molecole volatili annotate sono state rilevate dalle mono-e co-colture a 24 e 48 ore di tempo.

C'era più incorporazione di 13C in molecole volatili completamente etichettate rispetto al deuterio. 13C è stato incorporato in 2-butanone, 3-idrossi, 2, 3-butandione diacetile, acido acetico e fenolo per tutti i campioni fecali, fognari e salivari. L'acetone, l'acido butanoico e l'acido propanoico sono stati rilevati come etichettati nella saliva e nelle acque reflue.

mentre il dimetil trisolfuro e il disolfuro dimetile sono stati arricchiti sia in campioni fecali che di saliva. I volatili 1-propanolo, 2-butanone, benzofenone, etanolo e metiltiolo acetato sono stati arricchiti solo nelle acque reflue e 2, 3-pentanedione nella saliva. Il deuterio è stato incorporato nei volatili acido acetico, benzaldeide, 4-metil-dimetil trisolfuro e fenolo da campioni di saliva o acque reflue.

L'acido acetico, il dimetil trisolfuro, l'acetone e il propanolo 2-metile erano più abbondanti nei campioni di espettorato coltivati rispetto ai campioni di espettorato non coltivati. Un'analisi multivariata permutata delle varianti, un PERMANOVA, è stata eseguita su una matrice di distanza Bray-Curtis delle abbondanze volatili dai campioni di espettorato della fibrosi cistica. Abbiamo scoperto che il soggetto che ha donato il campione spiega il 51% della variazione nell'espettorato coltivato marcato con 13C e il 33% della variazione nell'espettorato non coltivato.

Qui, viene mostrato il successo dell'etichettatura isotopica stabile con glucosio 13C in sostanze volatili da campioni di espettorato in coltura raccolti da sette persone con fibrosi cistica. I volatili che hanno un'incorporazione 13C più alta per la maggior parte dei campioni sono mostrati nel pannello 5A, quelli con incorporazione 13C con percentuale inferiore nella maggior parte dei campioni di espettorato sono nel pannello 5B e le molecole con una conversione percentuale inferiore di 13C in una minoranza dei campioni di espettorato sono mostrate nel pannello 5C. Ricontrolla sempre le pressioni del flaconcino dopo circa un minuto.

Un vuoto rotto sconfigge la sensibilità e la velocità del metodo VASE. Seguendo questa procedura, se è stato eseguito il sondaggio isotopico stabile, il DNA può essere estratto dal materiale rimanente per identificare organismi microbici o specie che potrebbero aver contribuito alla produzione delle molecole volatili. Questo metodo è utile anche per rilevare sostanze volatili da qualsiasi tipo di campione senza sonda isotopica.

Con i vantaggi della sensibilità e del basso volume del campione, molte applicazioni possono trarre vantaggio da questa tecnica.