Registrazione di microelettrodi della velocità di attivazione dei nodi senoatriali per identificare i difetti intrinseci del pacemaking cardiaco nei topi

La misurazione della frequenza cardiaca intrinseca è un indicatore importante della salute cardiaca. Questa tecnica misura accuratamente questo tasso escludendo la maggior parte delle influenze confondenti sul nodo senoatriale. La registrazione MEA della frequenza cardiaca intrinseca acquisisce dati accurati sulla velocità di sparo simili alle registrazioni a cella singola senza un'ampia formazione elettrofisiologica.

Gli individui che utilizzano questa tecnica possono avere difficoltà a ottenere preparazioni di tessuti sani nei primi esperimenti, quindi pratica la dissezione e ottimizza i buffer e le impostazioni di raccolta dei dati prima di iniziare la raccolta dei dati reali. A dimostrare la procedura saranno i dottori Man Si e Praveen Kumar, ricercatori post-dottorato nel mio laboratorio. Inizia tenendo la pelle del topo eutanasizzato con un emostatico e usa le forbici chirurgiche per fare un'incisione trasversale nella pelle appena sotto il fondo della gabbia toracica dall'arco costale sinistro all'arco costale destro.

Utilizzare forbici chirurgiche per tagliare il peritoneo e separare accuratamente il fegato dal diaframma senza graffiare il fegato per prevenire un eccessivo sanguinamento. Incidere il diaframma lungo il torace per esporre la cavità toracica. Utilizzare le forbici chirurgiche per tagliare le pareti laterali della cassa toracica dai bordi degli archi costali fino alle claviglie per esporre il cuore, quindi utilizzare un ago a siringa calibro 23 per fissare la cassa toracica sopra la spalla.

Utilizzare una pipetta di trasferimento per far cadere la soluzione completa di Tyrode eparinata calda sul cuore per mantenerlo umido. Tenere i polmoni con una pinza Graefe extra fine e scidere la trachea con forbici chirurgiche per rimuovere i polmoni. Per rimuovere il cuore, tenere l'apice del cuore con una pinza Graefe extra fine e tagliare l'aorta e la vena cava inferiore con le forbici chirurgiche.

Trasferire il cuore in una capsula di Petri contenente elastomero siliconico polimerizzato e utilizzare una pipetta di trasferimento per bagnare il cuore con due o tre millilitri di soluzione completa di Tyrode eparinata calda. Attaccare l'apice del cuore al piatto con un perno di dissezione. Tenere la vena cava inferiore con dumont 2 pinna per laminectomia.

Inserire un ago per siringa calibro 22 attraverso la vena cava inferiore e superiore per individuare la loro posizione nell'atrio destro, che identifica anche la posizione approssimativa del nodo senoatriale. Tenere l'appendice atriale destra con pinci per laminectomia Dumont 2 e mettere una spilla di dissezione attraverso l'appendice atriale destra per tenerla in posizione. Ripetere la stessa procedura per l'appendice atriale sinistra, quindi rimuovere l'ago della siringa che attraversa la vena cavae.

Usa le forbici Castroviejo per rimuovere l'apice del cuore facendo un'incisione trasversale attraverso i ventricoli per rilasciare il sangue dal cuore, quindi lava il cuore aggiungendo la soluzione completa di Tyrode eparinata calda. Utilizzare le forbici Castroviejo per tagliare lungo il setto atrioventricolare fino a quando gli atri sono separati dai ventricoli e mantenere l'incisione più vicina al ventricolo. Tagliare lungo il setto interarteriale per rimuovere l'atrio sinistro.

Posiziona i perni di dissezione nella periferia dell'atrio destro per renderlo piatto. Rimuovere il grasso, i vasi o il tessuto rimanenti dall'atrio usando le forbici Castroviejo e individuare il nodo senoatriale nell'atrio destro. Aggiungere la soluzione di Tyrode al modello di soluzione di ingresso e attivare il flusso di gas carbogeno per ossigenare la soluzione di Tyrode.

Impostare la pompa peristaltica a 25 RPM, che dà una portata di due millilitri al minuto. Dopo aver avviato la pompa, assicurarsi che il buffer non perda dal sistema e impostare il regolatore di temperatura a 37 gradi Celsius. Utilizzare la pinzetto Dumont 55 per trasferire il tessuto sezionato dalla piastra di Petri dissezionante alla griglia dell'array di microelettrodi.

Posizionare delicatamente il tessuto con un pennello morbido per sovrapporre la regione del nodo senoatriale della griglia dell'elettrodo. Quindi posizionare la rete sopra il tessuto usando la pinica ossea o qualsiasi pinca curva. Usando la pinca ossea, posiziona l'ancora dell'arpa sulla rete per tenere tutto in posizione.

Disporre la parabola dell'array di microelettrodi sulla piastra del connettore. Posizionare con attenzione il cappuccio di perfusione sulla parabola della matrice di microelettrodi senza disturbare l'ancoraggio della fetta di arpa e fissare lo spazio di perfusione con del nastro adesivo. Accendere l'amplificatore e impostare un flusso di lavoro per la registrazione nel software.

Seleziona beat_recording. modello moflo. Aprirlo e impostare il numero di tracce, la durata della traccia, l'intervallo di traccia, la tensione di ingresso, la frequenza di campionamento e altri parametri di registrazione in base alle condizioni di registrazione desiderate.

Fare clic sul pulsante registra e riproduci per avviare la registrazione e acquisire i dati per 10 tracce della durata di un minuto con due minuti di intervalli tra le tracce. Mettere in pausa la pompa e commutare il tubo di afflusso della pompa dalla normale soluzione di registrazione alla soluzione di Tyrode contenente il farmaco desiderato di scelta. Riavviare la pompa e riprendere la registrazione.

Una volta che la soluzione di Tyrode infusa con il farmaco ha raggiunto il tessuto, registrare 10 tracce nello stesso modo in cui è stato fatto in precedenza per le registrazioni di base. Scatta una foto finale del posizionamento del tessuto sull'array di microelettrodi. Aprire il file di dati registrati salvato nel modello di analisi della frequenza di battita del software di analisi.

Fare clic sul gioco e consentire l'esecuzione dell'intera registrazione per la visualizzazione dei dati e quindi assegnare i parametri di analisi appropriati. Selezionare i canali da includere nell'analisi e impostare i valori di soglia minimi di ampiezza o ampiezza desiderati per l'identificazione automatica dei picchi di forma d'onda. Fare nuovamente clic sull'icona di riproduzione per eseguire nuovamente il set di dati e verificare che i parametri di analisi siano appropriati per un'estrazione di spike.

Per l'analisi, identificare le tre tracce consecutive più stabili che mostrano un tasso di battito stabile per ogni traccia attraverso la maggior parte dei canali durante il periodo basale dell'esperimento e altre tre tracce stabili consecutive durante il periodo di esposizione al farmaco. Fare clic sull'icona di riproduzione e registrazione per avviare l'analisi. I dati sono stati raccolti da un topo svizzero nero wild-type maschio di 45 giorni per la misurazione della frequenza del battito del nodo senoatriale.

Le forme d'onda con diverse forme e ampiezze sono state osservate in canali diversi e tutti i canali hanno mostrato intervalli interspike e frequenze di sparo identici. Tuttavia, il grado di contatto tissutale con l'elettrodo può anche influenzare le caratteristiche della forma d'onda come l'ampiezza. Tra le 10 tracce registrate, i tre canali consecutivi con frequenza di battito stabile e intervallo interspike sono stati scelti per ulteriori analisi.

I cattivi schemi di picco estratti dovrebbero essere assenti, ma se presenti sono influenzati dal rumore o instabili. Le forme d'onda che corrispondono ai singoli battiti cardiaci riflettono l'attività intrinseca di pacemaking cardiaco. Il sistema di array di microelettrodi consente una facile applicazione di agenti farmacologici per analizzare gli effetti farmacologici.

La velocità di sparo intrinseca di tre tracce selezionate su tutti i 64 canali è risultata essere di circa 320 battiti al minuto nei dati di campionamento. L'introduzione della 4-aminopirimidina ha aumentato gli intervalli interspike come previsto, il che ha diminuito la frequenza del battito da 320 a 210 battiti al minuto. Per raccogliere dati affidabili per l'analisi, è importante confermare che il tessuto è sano durante la registrazione verificando che le tracce siano stabili e soddisfino i criteri standard.

I MEA possono essere utilizzati per registrare l'attività cardiaca in altre regioni del cuore, consentendo una caratterizzazione dettagliata specifica della regione che è suscettibile di studiare gli effetti della manipolazione genetica e farmacologica.