Name: Registrazione dellattività di rete nei circuiti nocicettivi spinali utilizzando array di microelettrodi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Scopri come registrare l'attività di rete nei circuiti nocicettivi spinali utilizzando array di microelettrodi in fette di midollo spinale di topo. Questo metodo permette di studiare il processamento sensoriale spinale e testare composti antinocicettivi.

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Questo lavoro è stato finanziato dal National Health and Medical Research Council (NHMRC) dell'Australia (sovvenzioni 631000, 1043933, 1144638 e 1184974 a B.A.G. e R.J.C.) e dall'Hunter Medical Research Institute (sovvenzione a B.A.G. e R.J.C.).

<ol><li>Smith, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calretinin+positive+neurons+form+an+excitatory+amplifier+network+in+the+spinal+cord+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Calretinin positive neurons form an excitatory amplifier network in the spinal cord dorsal horn.</a> eLife. 8, 49190(2019).</li>
<li>Smith, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+calretinin-expressing+neurons+in+the+mouse+superficial+dorsal+horn%3A+implications+for+spinal+pain+processing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of calretinin-expressing neurons in the mouse superficial dorsal horn: implications for spinal pain processing.</a> The Journal of physiology. 593 (19), 4319-4339 (2015).</li>
<li>Boyle, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+spinal+microcircuit+that+gates+myelinated+afferent+input%3A+Implications+for+tactile+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Defining a spinal microcircuit that gates myelinated afferent input: Implications for tactile allodynia.</a> Cell Reports. 28 (2), 526-540 (2019).</li>
<li>Browne, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+cross-referencing+of+inhibitory+and+excitatory+interneuron+populations+to+dissect+neuronal+heterogeneity+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transgenic cross-referencing of inhibitory and excitatory interneuron populations to dissect neuronal heterogeneity in the dorsal horn.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 32(2020).</li>
<li>Graham, B. A., Hughes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rewards%2C+perils+and+pitfalls+of+untangling+spinal+pain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rewards, perils and pitfalls of untangling spinal pain circuits.</a> Current Opinion in Physiology. 11, 35-41 (2019).</li>
<li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).</li>
<li>Hughes, D. I., Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+targets%3A+inhibitory+interneurons+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Central nervous system targets: inhibitory interneurons in the spinal cord.</a> Neurotherapeutics. 17 (3), 874-885 (2020).</li>
<li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+spinal+circuits+transmitting+and+gating+mechanical+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain.</a> Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).</li>
<li>Hachisuka, J., Chiang, M. C., Ross, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Itch+and+neuropathis+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Itch and neuropathis itch.</a> Pain. 159 (3), 603(2018).</li>
<li>Foster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation%2C+silencing%2C+and+activation+establish+glycinergic+dorsal+horn+neurons+as+key+components+of+a+spinal+gate+for+pain+and+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch.</a> Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).</li>
<li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+spinal+circuit+for+light+touch+and+fine+motor+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control.</a> Cell. 160 (3), 503-515 (2015).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+spinal+circuits+involved+in+touch-evoked+dynamic+mechanical+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of spinal circuits involved in touch-evoked dynamic mechanical pain.</a> Nature neuroscience. 20 (6), 804-814 (2017).</li>
<li>Peirs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+allodynia+circuitry+in+the+dorsal+horn+is+defined+by+the+nature+of+the+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mechanical allodynia circuitry in the dorsal horn is defined by the nature of the injury.</a> Neuron. 109 (1), 73-90 (2021).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+dissection+of+the+role+of+somatostatin+in+itch+and+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit dissection of the role of somatostatin in itch and pain.</a> Nature Neuroscience. 21 (5), 707-716 (2018).</li>
<li>Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+neuronal+function+through+microelectrode+array+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Revealing neuronal function through microelectrode array recordings.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 423(2015).</li>
<li>Nam, Y., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+microelectrode+array+technology+and+neural+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">In vitro microelectrode array technology and neural recordings.</a> Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).</li>
<li>Johnstone, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+arrays%3A+a+physiologically+based+neurotoxicity+testing+platform+for+the+21st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Microelectrode arrays: a physiologically based neurotoxicity testing platform for the 21st century.</a> Neurotoxicology. 31 (4), 331-350 (2010).</li>
<li>Stett, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+application+of+microelectrode+arrays+in+drug+discovery+and+basic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biological application of microelectrode arrays in drug discovery and basic research.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 377 (3), 486-495 (2003).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+and+recent+development+of+the+microelectrode+arrays+%28MEAs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Trends and recent development of the microelectrode arrays (MEAs).</a> Biosensors and Bioelectronics. 175 (1), 112854(2020).</li>
<li>Chapman, R. J., Cilia La Corte, P. F., Asghar, A. U. R., King, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network-based+activity+induced+by+4-aminopyridine+in+rat+dorsal+horn+in+vitro+is+mediated+by+both+chemical+and+electrical+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Network-based activity induced by 4-aminopyridine in rat dorsal horn in vitro is mediated by both chemical and electrical synapses.</a> The Journal of Physiology. 587, Pt 11 2499-2510 (2009).</li>
<li>Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptiform+activity+in+rat+spinal+dorsal+horn+in+vitro+has+common+features+with+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Epileptiform activity in rat spinal dorsal horn in vitro has common features with neuropathic pain.</a> Pain. 105 (1-2), 327-338 (2003).</li>
<li>Kay, C. W., Ursu, D., Sher, E., King, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Cx36+and+Cx43+in+4-aminopyridine-induced+rhythmic+activity+in+the+spinal+nociceptive+dorsal+horn%3A+an+electrophysiological+study+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of Cx36 and Cx43 in 4-aminopyridine-induced rhythmic activity in the spinal nociceptive dorsal horn: an electrophysiological study in vitro.</a> Physiological Reports. 4 (14), 12852(2016).</li>
<li>Jankowska, E., Lundberg, A., Rudomin, P., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+4-aminopyridine+on+synaptic+transmission+in+the+cat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of 4-aminopyridine on synaptic transmission in the cat spinal cord.</a> Brain Research. 240 (1), 117-129 (1982).</li>
<li>Semba, K., Geller, H. M., Egger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Aminopyridine+induces+expansion+of+cutaneous+receptive+fields+of+dorsal+horn+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">4-Aminopyridine induces expansion of cutaneous receptive fields of dorsal horn cells.</a> Brain Research. 343 (2), 398-402 (1985).</li>
<li>Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+oscillatory+Ca2%2B+waves+in+rat+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Long-range oscillatory Ca2+ waves in rat spinal dorsal horn.</a> European Journal of Neuroscience. 22 (8), 1967-1976 (2005).</li>
<li>Egert, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+organotypic+long-term+culture+of+the+rat+hippocampus+on+substrate-integrated+multielectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated multielectrode arrays.</a> Brain Research Protocols. 2 (4), 229-242 (1998).</li>
<li>Thiebaud, P., De Rooij, N., Koudelka-Hep, M., Stoppini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+arrays+for+electrophysiological+monitoring+of+hippocampal+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microelectrode arrays for electrophysiological monitoring of hippocampal organotypic slice cultures.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 44 (11), 1159-1163 (1997).</li>
<li>Rey, H. G., Pedreira, C., Quiroga, R. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past%2C+present+and+future+of+spike+sorting+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Past, present and future of spike sorting techniques.</a> Brain Research Bulletin. 119, 106-117 (2015).</li>
<li>Satuvuori, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measures+of+spike+train+synchrony+for+data+with+multiple+time+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Measures of spike train synchrony for data with multiple time scales.</a> Journal of Neuroscience Methods. 287, 25-38 (2017).</li>
<li>Mendis, G. D. C., Morrisroe, E., Reid, C. A., Halgamuge, S. K., Petrou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+local+field+potentials+of+dissociated+cultures+grown+on+multi-electrode+arrays+for+pharmacological+assays%5BTitle%5D)+AND+%2238th+Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Use of local field potentials of dissociated cultures grown on multi-electrode arrays for pharmacological assays.</a> 38th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 952-956 (2016).</li>
<li>Hughes, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological%2C+neurochemical+and+electrophysiological+features+of+parvalbumin-expressing+cells%3A+a+likely+source+of+axo-axonic+inputs+in+the+mouse+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Morphological, neurochemical and electrophysiological features of parvalbumin-expressing cells: a likely source of axo-axonic inputs in the mouse spinal dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 590 (16), 3927-3951 (2012).</li>
<li>Peirs, C., Seal, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+for+pain%3A+recent+advances+and+current+views%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural circuits for pain: recent advances and current views.</a> Science. 354 (6312), 578-584 (2016).</li>
<li>Li, J., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+membrane+excitability+in+rat+spinal+lamina+I+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of membrane excitability in rat spinal lamina I projection neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2604-2614 (2012).</li>
<li>Li, J., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+neurons+within+newborn+spinal+pain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pacemaker neurons within newborn spinal pain circuits.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 9010-9022 (2011).</li>
<li>Sandkühler, J., Eblen-Zajjur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+rhythmic+nociceptive+and+non-nociceptive+spinal+dorsal+horn+neurons+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of rhythmic nociceptive and non-nociceptive spinal dorsal horn neurons in the rat.</a> Neuroscience. 61 (4), 991-1006 (1994).</li>
<li>Lucas-Romero, J., Rivera-Arconada, I., Roza, C., Lopez-Garcia, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+classification+of+spontaneous+discharges+in+mouse+superficial+dorsal+horn+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Origin and classification of spontaneous discharges in mouse superficial dorsal horn neurons.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9735-9735 (2018).</li>
<li>Antonio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L.+al.+In+vitro+seizure+like+events+and+changes+in+ionic+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">L. al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, 33-44 (2016).</li>
<li>Avoli, M., Jefferys, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+drug-induced+epileptiform+synchronization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).</li>
<li>Taccola, G., Nistri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+micromolar+concentrations+of+4-aminopyridine+facilitate+fictive+locomotion+expressed+by+the+rat+spinal+cord+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Low micromolar concentrations of 4-aminopyridine facilitate fictive locomotion expressed by the rat spinal cord in vitro.</a> Neuroscience. 126 (2), 511-520 (2004).</li>
<li>Mitra, P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+spinal+cord+slice+preparation+for+recording+from+lumbar+motoneurons+of+the+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (2), 728-741 (2012).</li>
<li>Egert, U., Heck, D., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+monitoring+of+spiking+networks+in+acute+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional monitoring of spiking networks in acute brain slices.</a> Experimental Brain Research. 142 (2), 268-274 (2002).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Nonostante l'importanza del DH spinale nella segnalazione nocicettiva, nell'elaborazione e nelle conseguenti risposte comportamentali ed emotive che caratterizzano il dolore, i circuiti all'interno di questa regione rimangono poco compresi. Una sfida chiave nello studio di questo problema è stata la diversità delle popolazioni di neuroni che comprendono questi circuiti 6,31,32. I recenti progressi nelle tecnologie transgeniche, ...

I ruoli di specifici tipi di interneuroni inibitori ed eccitatori all'interno del DH del midollo spinale vengono scoperti ad un ritmo rapido 1,2,3,4. Insieme, gli interneuroni costituiscono oltre il 95% dei neuroni nel DH e sono coinvolti nell'elaborazione sensoriale, compresa la nocicezione. Inoltre, questi circuiti interneuronici sono importanti per determinare se i segnali periferici salgono sul neuroassi per raggiungere il cervello e contribuire alla percezione del dolore 5,6,7. Ad oggi, la maggior parte degli studi ha studiato il ruolo dei neuroni DH a livello di analisi a singola cellula o intero organismo utilizzando combinazioni di elettrofisiologia intracellulare in vitro, etichettatura neuroanatomica e analisi comportamentale in vivo 1,3,8,9,10,11,12,13,14 . Questi approcci hanno notevolmente migliorato la comprensione del ruolo di specifiche popolazioni di neuroni nell'elaborazione del dolore. Tuttavia, rimane una lacuna nella comprensione di come specifici tipi di cellule e piccoli macro-circuiti influenzino grandi popolazioni di neuroni a livello di microcircuito per modellare successivamente l'output del DH, le risposte comportamentali e l'esperienza del dolore.
Una tecnologia in grado di studiare la funzione macro-circuito o multicellulare è il microelectrode array (MEA)15,16. I MEA sono stati utilizzati per studiare la funzione del sistema nervoso per diversi decenni17,18. Nel cervello, hanno facilitato lo studio dello sviluppo neuronale, della plasticità sinaptica, dello screening farmacologico e dei test di tossicità17,18. Possono essere utilizzati sia per applicazioni in vitro che in vivo, a seconda del tipo di MEA. Inoltre, lo sviluppo dei MEA si è evoluto rapidamente, con diversi numeri di elettrodi e configurazioni ora disponibili19. Un vantaggio chiave dei MEA è la loro capacità di valutare simultaneamente l'attività elettrica in molti neuroni con elevata precisione spaziale e temporale tramite più elettrodi15,16. Ciò fornisce una lettura più ampia di come i neuroni interagiscono in circuiti e reti, in condizioni di controllo e in presenza di composti applicati localmente.
Una sfida dei preparati DH in vitro è che i livelli di attività in corso sono in genere bassi. Qui, questa sfida viene affrontata nei circuiti DH del midollo spinale utilizzando il bloccante del canale K + voltaggio-gated, 4-aminopryidine (4-AP), per stimolare chimicamente i circuiti DH. Questo farmaco è stato precedentemente utilizzato per stabilire l'attività elettrica sincrona ritmica nel DH di fette acute del midollo spinale e in condizioni acute in vivo 20,21,22,23,24. Questi esperimenti hanno utilizzato patch monocellulare e registrazione extracellulare o imaging del calcio per caratterizzare l'attività indotta da 4-AP 20,21,22,23,24,25. Insieme, questo lavoro ha dimostrato il requisito della trasmissione sinaptica eccitatoria e inibitoria e delle sinapsi elettriche per l'attività ritmica indotta da 4-AP. Pertanto, la risposta 4-AP è stata vista come un approccio che smaschera i circuiti DH polisinaptici nativi con rilevanza biologica piuttosto che come un epifenomeno indotto da farmaci. Inoltre, l'attività indotta da 4-AP mostra un profilo di risposta simile ai farmaci analgesici e antiepilettici come le condizioni di dolore neuropatico ed è stata utilizzata per proporre nuovi bersagli farmacologici analgesici a base spinale come le connessioni 20,21,22.
Qui, viene descritta una preparazione che combina MEA e attivazione chimica del DH spinale con 4-AP per studiare questo circuito nocicettivo al macro-circuito, o a livello di rete di analisi. Questo approccio fornisce una piattaforma stabile e riproducibile per studiare i circuiti nocicettivi in condizioni ingenue e neuropatiche "simili al dolore". Questa preparazione è anche facilmente applicabile per testare l'azione a livello circuitale di analgesici noti e per lo screening di nuovi analgesici nel midollo spinale iperattivo.

<table><tbody><tr><td>4-amminopiridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>275875-5G</td><td></td></tr><tr><td>100% etanolo</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA214-2.5LPL</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 1M</td><td>Banksia Scientific</td><td>0430/1L</td><td></td></tr><tr><td>Carbonox (Carbogen - 95% O2, 5% CO2)</td><td>Coregas</td><td>219122</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla curve a manico lungo</td><td>Fine Science Tools</td><td>15015-11</td><td></td></tr><tr>Camera <td></td><td></td><td></td><td>di incubazione con interfaccia d'aria su misura</td></tr><tr><td>Siero bovino fetale</td><td>Thermo Fisher</td><td>10091130</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA783-500G</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo</td><td>Thermo Fisher</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA383-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Ceva</td><td>KETALAB04</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche di grandi dimensioni</td><td>Fine Science Tools</td><td>14007-14</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 454 Bulloni adesivi istantanei</td><td>e forniture industriali</td><td>L4543G</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>R2018b</td></tr><tr><td>MEA,</td><td>sistemi multicanale</td> tridimensionali <td>60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti</td><td>60 elettrodi in nitruro di titanio (TiN) con 1 elettrodo di riferimento interno, organizzati in una griglia quadrata 8x8. Gli elettrodi sono 12 &micro; m di diametro, 40 & micro; m (100/12/40) o 50 &micro; m (200/12/50) alto e equidistante 100 &; m (100/12/40) o 200 &micro; m (200/12/50) a parte.</td></tr><tr><td>MEA headstage</td><td>Sistemi multicanale</td><td>MEA2100-HS60</td><td></td></tr><tr><td>Scheda di interfaccia MEA</td><td>Sistemi multicanale</td><td>MCS-IFB 3.0 Multiboot</td><td></td></tr><tr><td>MEA net</td><td>Sistemi multicanale</td><td>ALA HSG-MEA-5BD</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di perfusione MEA</td><td>Sistemi multicanale</td><td>PPS2</td><td></td></tr><tr><td>MEA, Sistemi multicanale planari</td><td></td><td>60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti</td><td>60 elettrodi in nitruro di titanio (TiN) con 1 elettrodo di riferimento interno, organizzati in una griglia quadrata 8x8 (200/30) o in una griglia rettangolare 6x10 (500/30). Gli elettrodi sono 30 & micro; m di diametro e equidistanti 200 & micro; m (200/30) o 500 &micro; m (500/30) a parte.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA296-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera per microscopio</td><td>Motic Moticam</td><td>X Wi-Fi</td><td></td></tr><tr><td>Software per analizzatore multicanale</td><td>Sistemi</td><td></td> multicanale <td>V 2.17.4</td></tr><tr><td>Software per sperimentatore multicanale</td> Sistemi <td>multicanale</td><td></td><td>V 2.17.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA465-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA475-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Thermo Fisher</td><td>ACR207805000</td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs Fine</td><td>Science Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Piccole forbici a molla</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Piccole forbici chirurgiche</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA530-500G</td><td></td></tr><tr><td>Supercolla</td><td></td><td></td><td>cianoacrilato</td></tr><tr><td>adesivo Tetrodotossina</td><td>Abcam</td><td>AB120055</td><td></td></tr><tr><td>Tabella di isolamento dalle vibrazioni</td><td>Newport</td><td>VH3048W-OPT</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo vibrante</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr></tbody></table>

registrazione dell'attività di rete nei circuiti nocicettivi spinali utilizzando array di microelettrodi

Recording Network Activity in Spinal Nociceptive Circuits Using Microelectrode Arrays

I ruoli e la connettività di specifici tipi di neuroni all'interno del corno dorsale del midollo spinale (DH) vengono delineati a un ritmo rapido per fornire una visione sempre più dettagliata dei circuiti alla base dell'elaborazione del dolore spinale. Tuttavia, gli effetti di queste connessioni per una più ampia attività di rete nel DH rimangono meno ben compresi perché la maggior parte degli studi si concentra sull'attività di singoli neuroni e piccoli microcircuiti. In alternativa, l'uso di array di microelettrodi (MEA), in grado di monitorare l'attività elettrica su molte cellule, fornisce un'elevata risoluzione spaziale e temporale dell'attività neurale. Qui, viene descritto l'uso di MEA con fette di midollo spinale di topo per studiare l'attività dh indotta da circuiti DH chimicamente stimolanti con 4-aminopiridina (4-AP). L'attività ritmica risultante è limitata al DH superficiale, stabile nel tempo, bloccata dalla tetrodotossina, e può essere studiata in diversi orientamenti delle fette. Insieme, questa preparazione fornisce una piattaforma per studiare l'attività del circuito DH nei tessuti di animali naïve, modelli animali di dolore cronico e topi con funzione nocicettiva geneticamente alterata. Inoltre, le registrazioni MEA in fette di midollo spinale stimolate da 4-AP possono essere utilizzate come strumento di screening rapido per valutare la capacità di nuovi composti antinocicettivi di interrompere l'attività nel DH del midollo spinale.

Modello di attività di rete nel corno dorsale del midollo spinale L'applicazione di 4-AP induce in modo affidabile l'attività ritmica sincrona nel DH del midollo spinale. Tale attività si presenta come un aumento degli EAP e dei LFP. Il segnale successivo è una forma d'onda a bassa frequenza, che è stata precedentemente descritta nelle registrazioni MEA30. I cambiamenti nell'attività EAP e/ o LFP dopo l'applicazione del farmaco riflettono un'attività neurale alterata. Esempi di...

Viene delineato l'uso combinato della tecnologia microelectrode array e della stimolazione chimica indotta da 4-aminopiridina per studiare l'attività nocicettiva a livello di rete nel corno dorsale del midollo spinale.

Registrazione dell'attività di rete nei circuiti nocicettivi spinali utilizzando array di microelettrodi

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an ...

La preparazione della fetta spinale MEA 4-AP descritta fornisce una piattaforma per studiare la connettività dei circuiti del corno dorsale e come queste reti interagiscono durante l'elaborazione sensoriale spinale. La metodologia presentata consente di studiare l'attività del circuito del corno dorsale a livello macroscopico regionale di risoluzione. Questa preparazione può essere utilizzata come strumento di screening rapido per valutare la capacità dei composti di interrompere la segnalazione nei circuiti sensoriali spinali.Questo metodo aiuta a colmare il divario nella nostra comprensione di come l'attività di specifici tipi di cellule e piccoli micro circuiti influenzano grandi popolazioni di neuroni per modellare successivamente l'output delle risposte comportamentali del corno dorsale e, in definitiva, l'esperienza del dolore. Per iniziare, riempire bene il MEA con siero di cavallo per 30 minuti. Dopo aver rimosso il siero, sciacquare accuratamente il MEA cinque volte con acqua distillata fino a quando l'acqua distillata diventa non schiumosa.Quindi, riempire il pozzo con liquido cerebrospinale artificiale. Dopo aver decapitato il topo anestetizzato, rimuovere la pelle sulla regione addominale facendo un piccolo taglio nella pelle a livello dei fianchi. Quindi, tirare la pelle su entrambi i lati del taglio rostralmente fino a quando tutta la pelle viene rimossa dalla parte superiore della gabbia toracica alla parte superiore del bacino, sia ventralmente che dorsalmente.Dopo aver posizionato il corpo sul ghiaccio, utilizzare un approccio ventrale per esporre la colonna vertebrale rimuovendo i visceri e tagliando le costole lateralmente allo sterno. Rimuovere la gabbia toracica ventrale, entrambe le scapole, gli arti inferiori e il bacino. Trasferire la colonna vertebrale e la preparazione delle costole in un bagno di dissezione contenente liquido cerebroso artificiale ghiacciato.Pin tutti e quattro gli angoli della preparazione posizionando i perni attraverso i muscoli della parte bassa della schiena e le costole superiori attaccate. Rimuovere tutti i muscoli e il tessuto connettivo sovrastanti la superficie ventrale delle vertebre con i rongeurs e identificare la regione vertebrale sopra l'allargamento lombo-sacrale, che si trova approssimativamente sotto i corpi vertebrali T12-L2. Rimuovere un corpo vertebrale caudale alla regione di allargamento lombo-sacrale per accedere al midollo spinale seduto sul canale vertebrale.Usando forbici a molla curve, tagliare bilateralmente i frontoni vertebrali mentre si solleva e si tira il corpo vertebrale rostralmente per separare gli aspetti ventrali e dorsali delle vertebre ed esporre il midollo spinale. Una volta rimossi i corpi vertebrali per rivelare l'allargamento lombo-sacrale, cancellare con cura le radici rimanenti che ancorano il midollo spinale con forbici a molla fino a quando il cordone galleggia libero. Isolare il midollo spinale con tagli rostrali e caudali sopra e sotto l'allargamento lombo-sacrale per far galleggiare liberamente la regione target del cordone.Per le fette trasversali, sollevare e posizionare il segmento lombo-sacrale per un percorso attaccato su un blocco di polistirene pretagliato con un canale poco profondo tagliato al centro. Quindi, utilizzare l'adesivo cianoacrilato per fissare il blocco e il cavo alla piattaforma di sezionamento e posizionarlo nel bagno di taglio contenente liquame artificiale CSF di saccarosio ghiacciato. Una volta ottenute le fette spesse 300 micrometri, trasferire le fette in una camera di incubazione dell'interfaccia d'aria contenente liquido cerebrospinale artificiale ossigenato e lasciare che le fette si equilibrino per un'ora a temperatura ambiente.Per iniziare a registrare l'attività del corno dorsale, trasferire la fetta dall'incubatrice al pozzo MEA utilizzando una grande pipetta pasteur a punta riempita con liquido cerebrospinale artificiale e aggiungere ulteriore liquido cerebrospinale artificiale. Utilizzare un pennello per capelli corti per posizionare la fetta sopra l'array di registrazione a 60 elettrodi. Quindi, posizionare un collo pesato sul tessuto per tenerlo in posizione e promuovere un buon contatto con gli elettrodi MEA.Posizionare il MEA nella fase di testa della registrazione. Controllare la posizione del tessuto sopra gli elettrodi utilizzando un microscopio invertito per confermare che il maggior numero possibile di elettrodi si trova sotto il DH superficiale. Assicurarsi che almeno due o sei elettrodi non entrino in contatto con la fetta. Dopo aver collegato la fotocamera al dispositivo, acquisire un'immagine di riferimento della fetta relativa al MEA da utilizzare durante l'analisi.Quindi, premere start DAQ nel software di registrazione e confermare che tutti gli elettrodi ricevano un segnale chiaro. Quindi, collegare le linee di ingresso e uscita della perfusione al MEA ben riempito con liquido cerebrospinale artificiale e accendere il sistema di perfusione. Controllare la portata e assicurarsi che il deflusso sia sufficiente per evitare il trabocco del superfusato.Dopo aver equilibrato il tessuto per cinque minuti, registrare i dati grezzi di base per cinque minuti. Spostare la linea di ingresso della perfusione dal liquido cerebrospinale artificiale a una soluzione di 4-aminopiridina e attendere 12 minuti affinché l'attività ritmica indotta dalla 4-aminopiridina raggiunga lo stato stazionario. Quindi, registrare cinque minuti di attività indotta da 4-aminopiridina ed essere preparati per le registrazioni successive per testare i farmaci o verificare la stabilità della 4-aminopiridina.Dopo ogni sessione di registrazione, sciacquare le linee con liquido cerebrospinale artificiale. Dopo aver rimosso il MEA dallo stadio di testa e rimosso la rete e il tessuto dal pozzo MEA, sciacquare il MEA e la rete con CSF artificiale e ripetere l'intero processo con una nuova fetta. Aprire il software di analisi e caricare il layout di analisi predefinito.Aprire il file di interesse e deselezionare l'elettrodo di riferimento e gli eventuali elettrodi ritenuti eccessivamente rumorosi. Impostare la finestra temporale per l'analisi. Quindi, passare alla scheda filtro tra canali.Selezionare gli elettrodi di riferimento e di riferimento complessi in base all'immagine scattata e alle note prese durante l'esperimento e premere Esplora prima di continuare. Passare alla scheda Filtro EAP e applicare un filtro Butterworth passa-alto di secondo ordine per rimuovere l'attività LFP. Passare alla scheda Filtro LFP e applicare un filtro Butterworth passa banda di secondo ordine per rimuovere l'attività EAP.Nella scheda Rilevatore EAP, assicurarsi di selezionare la soglia automatica, selezionare le caselle del bordo ascendente e discendente e impostare il tempo morto su tre millisecondi. Per impostare soglie positive e negative, ispezionare i dati tornando alla schermata dell'analizzatore di dati non elaborati, spostando l'indicatore temporale, tornando alla scheda del rilevatore EAP e premendo esplora. Ripetere il processo fino a quando la soglia di rilevamento impostata acquisisce gli EAP senza catturare il rumore o l'attività non fisiologica.Nella scheda Del rilevatore LFP, assicurarsi di selezionare la soglia manuale, selezionare le caselle del bordo ascendente e discendente e impostare il tempo morto su tre millisecondi. Impostare la soglia per un elettrodo e, una volta soddisfatto, selezionare applica a tutti e quindi premere avvia analisi. L'applicazione in bagno dell'antagonista del canale del sodio voltaggio-dipendente tetrodotossina ha abolito sia l'attività EAP che LFP, confermando la dipendenza da picchi di questi segnali.La stabilità dei parametri di attività indotta da 4-aminopiridina è stata caratterizzata per EAP o LFP. Tutte le caratteristiche di attività più la coincidenza di attività per le LFP erano stabili in base alla somiglianza dell'attività indotta da 4-aminopiridina a 12 minuti dopo l'applicazione di 4-aminopiridina e 15 minuti dopo. Gli EAP o LFP della funzione sono stati caratterizzati da un aumento del numero di eventi coincidenti rilevati su più elettrodi.Il numero di elettrodi adiacenti collegati e la forza dei collegamenti tra elettrodi adiacenti e LFP dopo stimolazione della 4-aminopiridina e quindi stabilità relativa. L'orientamento della fetta è una considerazione importante per i preparati in vitro. La stimolazione della 4-aminopiridina ha indotto un'attività ritmica simile nell'SDH indipendentemente dall'orientamento della fetta.Infine, per far ulteriore luce sulla rilevanza dell'attivazione della 4-aminopiridina delle reti DH, è stata applicata una soluzione di CSF artificiale di potassio elevata e ha dimostrato di evocare una risposta DH simile alla stimolazione della 4-aminopiridina. I passaggi chiave del protocollo sono nella preparazione del tessuto e nel posizionamento delle sezioni, assicurando che il tessuto sia sano attraverso un'attenta, ma tempestiva, dissezione, nonché un delicato posizionamento ottimale del tessuto sul MEA aiuteranno a ottenere risultati di qualità.

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Neuroscienze

Il video dimostra come utilizzare un array di microelettrodi (MEA) per registrare l'attività elettrofisiologica dei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). L'attività elettrofisiologica di un MEA multipozzetto contenente una co-coltura neurone-astrocitario viene registrata per rilevare potenziali d'azione da più neuroni nella rete, confermando il successo della differenziazione delle hiPSC in neuroni.

Misurazione dell'attività elettrofisiologica delle reti neuronali utilizzando array di microelettrodi

Questo video dimostra la registrazione dell'attività neurale spontanea e dipendente dalla stimolazione da colture primarie di neuroni gangliari a spirale murina (SGN) su un array multielettrodo (MEA). Implica il lavaggio e la preparazione del MEA, la registrazione dell'attività neurale spontanea e l'applicazione di stimoli elettrici controllati per identificare l'attività neuronale dipendente dalla stimolazione.

Analisi dell'attività neurale nei neuroni gangliari a spirale murini primari utilizzando array multielettrodi

Questo video descrive la registrazione intracellulare in vivo di motoneuroni di ratto sotto stimolazione transspinale a corrente continua. Il protocollo descrive come misurare le proprietà della membrana e registrare l'attivazione ritmica dei motoneuroni prima, durante e dopo la polarizzazione anodica o catodica del midollo spinale.

Stimolazione transspinale a corrente continua del motoneurone spinale di un ratto

Questo video mostra un test basato su array di microelettrodi per studiare l'attività della rete neuronale in sezioni di midollo spinale di topo. In primo luogo, viene registrata l'attività elettrofisiologica del corno dorsale superficiale (SDH) della fetta. Quindi, viene introdotto un inibitore del canale del potassio per prolungare la depolarizzazione, con conseguente attività ritmica sincrona attraverso la rete neuronale.

Valutazione basata su array di microelettrodi delle reti neuronali in fette di midollo spinale di topo

Questo video mostra una registrazione a fibra singola della conduzione nervosa della fibra C nei ratti. Un ratto anestetizzato viene inciso per esporre il nervo sciatico, che fornisce l'apporto sensoriale e motorio agli arti inferiori. Le singole fibre C vengono quindi esposte. La stimolazione elettrica viene fornita utilizzando elettrodi di stimolo impiantati nel piede e una risposta viene registrata da una singola fibra nervosa.

Registrazione in vivo a fibra singola delle fibre C del nervo sciatico nei ratti

Vi illustriamo come eseguire registrazione ed elettrica modulazione di attività epileptiform indotta da 4-aminopyridine in fettine di cervello del roditore utilizzando matrici microelettrodo. Una camera di registrazione personalizzata mantiene la vitalità del tessuto durante prolungate sessioni sperimentali. Live mapping di elettrodo e selezione di coppie stimolante sono eseguite da un'interfaccia di utente grafica personalizzata.

Registrazione e modulazione di attività Epileptiform in fettine di cervello del roditore accoppiate a matrici di microelettrodi

Abbiamo sviluppato una tecnica che registra simultaneamente sia electrocorticography e potenziali di campo locale in risposta a stimoli nocicettivi laser da liberi di muoversi. Questa tecnica aiuta a stabilire un rapporto diretto di electrocortical segnali a livello macroscopico e mesoscopiche che facilita l'indagine nocicettive di elaborazione delle informazioni nel cervello.

Registrazioni simultanee di potenziali di campo locale corticale ed Electrocorticograms in risposta a stimoli nocicettivi Laser da liberi di muoversi

La registrazione a fibra singola è una tecnica elettrofisiologica efficace applicabile al sistema nervoso centrale e periferico. Insieme alla preparazione della DRG intatta con il nervo sciatico attaccato, viene esaminato il meccanismo di guasto della conduzione. Entrambi i protocolli migliorano la comprensione del rapporto del sistema nervoso periferico con il dolore.

Uso della registrazione in fibra singola in vivo e della radice dorsale intatta Ganglion con il nervo Sciatico attaccato per esaminare il meccanismo del fallimento della conduzione

Questo protocollo descrive la registrazione intracellulare in vivo dei motoneuroni lombari con stimolazione simultanea della corrente diretta trans-spinale. Il metodo ci permette di misurare le proprietà della membrana e di registrare la cottura ritmica dei motoneuroni prima, durante e dopo la polarizzazione anodale o tadale del midollo spinale.

In Vivo Registrazione intracellulare di Motoneuroni Spinali Ratti Identificati dal Tipo durante la stimolazione a corrente diretta trans-spinale

APTrack è un plugin software sviluppato per la piattaforma Open Ephys che consente la visualizzazione dei dati in tempo reale e il monitoraggio della soglia elettrica a circuito chiuso dei potenziali d'azione neuronali. Abbiamo usato con successo questo in microneurografia per nocicettori umani in fibra C e nocicettori in fibra C e fibra Aδ di topo.

Monitoraggio della soglia elettrica a circuito chiuso in tempo reale open source per la ricerca traslazionale del dolore

Qui presentiamo un metodo per valutare l'attivazione e il blocco degli assoni sensoriali nei nervi periferici in esperimenti acuti, anestetizzati e in vivo con ratti, utilizzando due tipi di misurazioni elettrofisiologiche spinali che possono discriminare l'attività dei sottotipi di fibre nervose: Potenziali di Campo Locali e registrazioni di singoli neuroni a ampio intervallo dinamico.

Metodi elettrofisiologici per valutare il blocco del dolore periferico in un ratto anestetizzato

Scopri come registrare l'attività di rete nei circuiti nocicettivi spinali utilizzando array di microelettrodi in fette di midollo spinale di topo. Questo metodo permette di studiare il processamento sensoriale spinale e testare composti antinocicettivi.

Registrazione dell'attività di rete nei circuiti nocicettivi spinali utilizzando array di microelettrodi

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