Valutazione basata su array di microelettrodi delle reti neuronali in fette di midollo spinale di topo

Prendi un array di microelettrodi, o MEA, bene, contenente aCSF. Posiziona una fetta di midollo spinale di topo nel pozzetto e fissala con una rete appesantita.

Posizionare il pozzetto MEA in un sistema di registrazione. Al microscopio, garantire il massimo contatto tra gli elettrodi MEA e il corno dorsale superficiale o SDH, una regione ricca di interneuroni.

Mantenere un flusso continuo di aCSF per equilibrare il tessuto.

I neuroni comunicano attraverso potenziali d'azione. L'afflusso di ioni sodio depolarizza la membrana, seguito dal deflusso di ioni potassio che provoca la ripolarizzazione. La membrana si iperpolarizza brevemente, impedendo un nuovo potenziale d'azione fino a quando il potenziale di riposo non viene ripristinato.

Registra l'attività neuronale spontanea dagli elettrodi MEA. I segnali che si verificano in concomitanza tra più elettrodi indicano una rete di neuroni collegati sinapticamente.

Introdurre un inibitore del canale del potassio per prolungare la depolarizzazione che porta ad un aumento della frequenza del potenziale d'azione e dell'attività ritmica sincrona in tutta la rete.

Altri elettrodi che mostrano segnali coincidenti indicano l'attività sincrona mediata dall'inibitore.

Per iniziare a registrare l'attività del corno dorsale, trasferire la fetta dall'incubatrice al pozzetto MEA utilizzando una pipetta Pasteur a punta larga riempita con liquido cerebrospinale artificiale e aggiungere ulteriore liquido cerebrospinale artificiale.

Utilizzare un pennello a pelo corto per posizionare la fetta sull'array di registrazione a 60 elettrodi. Quindi, posizionare una rete ponderata sul tessuto per tenerlo in posizione e favorire un buon contatto con gli elettrodi MEA.

Posizionare il MEA nella fase di registrazione. Controllare la posizione del tessuto sopra gli elettrodi utilizzando un microscopio invertito per confermare che il maggior numero possibile di elettrodi si trovi sotto il DH superficiale. Assicurarsi che almeno due o sei elettrodi non entrino in contatto con la fetta.

Dopo aver collegato la fotocamera al dispositivo, acquisire un'immagine di riferimento della fetta rispetto al MEA da utilizzare durante l'analisi. Quindi, premere Avvia DAQ nel software di registrazione e confermare che tutti gli elettrodi ricevano un segnale chiaro.

Quindi, collegare le linee di ingresso e uscita della perfusione al pozzetto MEA riempito con liquido cerebrospinale artificiale e accendere il sistema di perfusione. Controllare la portata e assicurarsi che il deflusso sia sufficiente per evitare il trabocco del superfusato. Dopo aver bilanciato il tessuto per cinque minuti, registrare i dati grezzi di base per cinque minuti.

Spostare la linea di ingresso della perfusione dal liquido cerebrospinale artificiale a una soluzione di 4-aminopiridina e attendere 12 minuti affinché l'attività ritmica indotta dalla 4-aminopiridina raggiunga lo stato stazionario. Quindi, registra cinque minuti di attività indotta dalla 4-aminopiridina e preparati per le registrazioni successive per testare i farmaci o verificare la stabilità della 4-aminopiridina.