De novo Identificazione di frame di lettura aperti tradotti attivamente con dati di profilazione dei ribosomi
18 febbraio 2022
La traduzione dei ribosomi decodifica tre nucleotidi per codone in peptidi. Il loro movimento lungo l'mRNA, catturato dalla profilazione dei ribosomi, produce le impronte che mostrano la periodicità caratteristica della tripletta. Questo protocollo descrive come utilizzare RiboCode per decifrare questa caratteristica prominente dai dati di profilazione dei ribosomi per identificare i frame di lettura aperti tradotti attivamente a livello di trascrittoma intero.
L'interpretazione dei dati di sequenziamento generati dall'esperimento di profilazione dei ribosomi è fondamentale per misurare quantitativamente le attività traslazionali dei ribosomi sull'mRNA e per studiare i meccanismi di regolazione traslazionale. In questo protocollo, descriveremo la procedura computazionale per l'utilizzo dei dati di profilazione del ribosoma e RiboCode, uno strumento da riga di comando per decodificare la traduzione di mRNA su scala genomica e risoluzione a singolo nucleotide. Questo metodo consente di cercare i nuovi peptidi derivanti dalle regioni genomiche al di fuori dei geni codificanti proteine annotate e offre l'opportunità di quantificare il tasso di traduzione dell'mRNA.
Per iniziare, apri una finestra del terminale Linux e crea un ambiente conda eseguendo il comando. Passare all'ambiente creato e installare RiboCode e le dipendenze eseguendo il comando. Per ottenere i file di riferimento del genoma per la sequenza di riferimento, visitare il sito Web Ensembl, quindi fare clic su Download, quindi su Download FTP.
Fare clic sull'opzione FASTA nella colonna DNA FASTA e selezionare la riga in cui la specie è umana, mostrata nella tabella nella pagina del sito Web. Nella pagina del sito Web Ensembl, copiare il collegamento come indicato nel testo, quindi scaricare e decomprimere i file nel terminale eseguendo il comando. Per l'annotazione di riferimento, fare clic con il pulsante destro del mouse su GTF nella colonna set di geni nell'ultima pagina Web aperta.
Copia il link e scaricalo usando il comando. Per ottenere sequenze di rRNA, aprire il browser del genoma UCSC, quindi fare clic su Strumenti e selezionare il browser delle tabelle nell'elenco a discesa. Nella pagina del browser del genoma UCSC, specificare mammifero per clade, umano per genoma, tutte le tabelle per gruppo, maschera R per tabella e genoma per regione.
Per filtrare, fate clic su Crea per passare a una nuova pagina e impostate la classe di rappresentazione in base alla corrispondenza con rRNA. Fare clic su Invia, quindi impostare il formato di output su sequenza e il nome del file di output come HG38_rRNA. FA. Infine, fare clic su Ottieni output, quindi selezionare Ottieni sequenza per recuperare la sequenza rRNA.
Per ottenere set di dati di profilatura dei ribosomi dall'archivio di lettura della sequenza, scaricare gli esempi di replica del gruppo di trattamento si-eIFe e rinominarli eseguendo il comando. Scaricare quindi gli esempi di replica del gruppo di controllo e rinominarli eseguendo il comando. Per rimuovere la contaminazione da rRNA, iniziare a indicizzare le sequenze di riferimento dell'rRNA eseguendo il comando.
Dopo l'indicizzazione, allineare le letture al riferimento all'rRNA per escludere le letture provenienti dall'rRNA eseguendo il comando. Inizia creando un indice del genoma eseguendo il comando. Quindi allineare le letture pulite senza contaminazione di rRNA al riferimento creato eseguendo il comando, quindi ordinare e indicizzare i file di allineamento eseguendo il comando.
Preparare le annotazioni della trascrizione eseguendo il comando. Selezionare frammenti protetti da ribosomi di lunghezze specifiche e identificare le loro posizioni del sito P eseguendo il comando. Modificare i file di configurazione per ogni esempio e unirli.
Quindi eseguire RiboCode eseguendo il comando. La distribuzione in frequenza delle lunghezze delle letture ha mostrato che la maggior parte dei frammenti protetti dai ribosomi corrispondono a 25-35 nucleotidi. Le posizioni del sito P per diverse lunghezze di frammenti protetti da ribosomi sono state determinate esaminando le distanze dalle loro cinque estremità prime ai codoni di inizio e arresto annotati.
I risultati della mappatura mostrano che 10.394 geni codificano per frame di lettura aperti annotati. Inoltre, 509 e 168 geni codificano per frame di lettura aperti a monte e a valle, mentre 939 geni codificano per frame di lettura aperti a monte o a valle, sovrapposti a frame di lettura aperti annotati noti. Inoltre, 68 geni codificanti proteine e 2.601 geni non codificanti codificano per nuovi frame di lettura aperti.
La distribuzione della lunghezza ha mostrato che i fotogrammi di lettura aperti a monte, a valle, nuovi e sovrapposti erano più brevi dei fotogrammi di lettura aperti annotati. I conteggi relativi dei frammenti protetti da ribosomi sono stati calcolati per ogni frame di lettura aperto, rivelando che le densità di ribosomi dei frame di lettura aperti a monte erano significativamente più alte nelle cellule carenti di eIF3e rispetto alle celle di controllo. L'analisi del metagene ha rivelato che una massa di ribosomi si è bloccata tra i codoni 25 e 75 a valle del codone iniziale, suggerendo che l'allungamento della traduzione potrebbe essere bloccato all'inizio nelle cellule carenti di eIF3e.
Sono stati esaminati i profili di densità dei siti P per i frame di lettura aperti a monte di PSMA6 e i frame di lettura aperti a valle del gene SENP3-EIF4A1, dimostrando i modelli di periodicità e densità dei frammenti protetti dai ribosomi. Il controllo delle posizioni delle letture intorno ai codoni di inizio e arresto delle regioni codificanti proteine note è necessario per valutare le proprietà periodiche delle letture per ogni lunghezza. RiboCode, insieme a un altro strumento da riga di comando, RiboMiner può anche eseguire il controllo di qualità e analisi multiple come quantificare e visualizzare le occupazioni dei ribosomi sui frame di lettura aperti previsti.
Questo strumento computazionale fornisce un modo ad alto throughput per identificare eventi di traduzione non canonici con dati di profilazione dei ribosomi in specifici contesti fisiologici e come la traduzione si modula in risposta allo stimolo.
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Panoramica
Questo studio esplora l'interpretazione computazionale dei dati di ribosome profiling per migliorare la comprensione della regolazione traslazionale nell'mRNA. Utilizzando RiboCode, i ricercatori possono identificare i frame di lettura aperti (ORF) attivamente tradotti a livello del genoma, svelando informazioni su peptidi non canonici e le loro dinamiche di traduzione.
Componenti chiave dello studio
Area di ricerca
- Regolazione traslazionale
- Espressione genica
- Biologia computazionale
Contesto
- Il ribosome profiling offre informazioni quantitative sull'attività ribosomale sull'mRNA.
- Comprendere le dinamiche della traduzione fornisce informazioni critiche sulla regolazione genica.
- Lo studio mira a utilizzare RiboCode per l'analisi della traduzione su scala genomica.
Metodi utilizzati
- Sperimentazioni di ribosome profiling per raccogliere dati di sequenziamento.
- Utilizzo di RiboCode per decodificare la traduzione dell'mRNA.
- Analisi dei frammenti protetti da ribosomi e delle posizioni del sito P per studiare le dinamiche di traduzione.
Risultati principali
- Identificazione di 10.394 geni con ORF annotati e vari eventi di traduzione nuovi.
- Aumento della densità di ribosomi in ORF a monte nelle cellule con deficit di eIF3e rispetto al controllo.
- Fermata dell'allungamento della traduzione osservata in certi geni, evidenziata dai profili di densità del sito P.
Concludenze
- Questo studio dimostra l'efficacia di RiboCode nell'analizzare i dati di ribosome profiling per scoprire nuovi eventi di traduzione.
- Sottolinea l'importanza della modulazione traslazionale in risposta a stimoli fisiologici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Ribosome profiling enables genome-wide detection of actively translated open reading frames, supporting target validation by revealing context-dependent translation events. RiboCode provides a scalable computational workflow to identify novel peptides and quantify ribosome occupancy, aiding mechanistic de-risking in early discovery. This approach enhances predictive confidence in lead identification by linking translational activity to physiological stimuli.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through detection of actively translated ORFs in specific physiological contexts.
- Operational Value: Supports biological de-risking by identifying functional translation events outside annotated coding regions.
- Scientific Value: Facilitates target confidence by linking ribosome density changes to genetic perturbations such as eIF3e deficiency.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by mapping ribosome-protected fragment densities across ORFs.
- Operational Value: Enables assay standardization through quantification of relative ribosome protected fragment counts per ORF.
- Scientific Value: Supports predictive confidence by revealing periodicity patterns and P-site density profiles indicative of active translation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by identifying translation modulation in response to stimuli.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation via visualization of ribosome occupancies.
- Scientific Value: Aids risk-adjusted advancement decisions by highlighting stalled translation elongation as a regulatory mechanism.
Pipeline & Workflow Integration
RiboCode integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification by providing genome-wide translation readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying novel translation events in non-coding regions.
- Screening: Delivers assay readiness through quantification and visualization of ribosome occupancy on predicted ORFs.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements such as ribosome density and P-site periodicity for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking translation dynamics to physiological stimuli like eIF3e deficiency.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable computational platform for analyzing ribosome profiling data across multiple experimental contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through detection of actively translated ORFs and quantification of translation rates.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via a streamlined pipeline from raw data to interpreted output files.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on translation evidence in disease-relevant contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in computational biology and ribosome profiling data interpretation.
- Dependent on access to genome reference files, annotation databases, and rRNA sequence resources.
- Necessitates cross-team standardization of configuration files and read length selection parameters.
- Involves adaptation considerations when applying the pipeline to different model systems or stimulus conditions.
- Practical limitation: Efficient identification of translating ORFs remains challenging due to distorted and ambiguous signals in ribosome profiling data.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:01
Environment Setup and RiboCode Installation
1:23
Data Preparation
3:35
Removing Ribosomal RNA Contamination
3:59
Aligning the Clean Reads to the Genome
4:25
Size Selection of Ribosome Protected Fragments, Identification of P-Sites, and De novo Annotate Translating Open Reading Frames
4:59
Results: Identification of the Novel Open Reding Frames (ORFs) with the Application of RiboCode
7:20
Conclusion
