Name: Ottica non lineare label-free per lo studio dei difetti tubulina-dipendenti nella mielina centrale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Scopri la microscopia a generazione di seconda armonica per rilevare oligodendrociti carichi di microtubuli in modelli di tubulinopatia. Questo metodo avanzato permette di studiare la dinamica dei microtubuli nella mielina centrale.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) attraverso le seguenti sovvenzioni: infraestructura 226450 a VP-CIO, infraestructura 255277 a V.P. e FORDECYT-PRONACES/194171/2020 a V.H. Riconosciamo il supporto di Juvenal Hernández Guevara al CIO nella realizzazione del video.

Tutte le procedure descritte sono state eseguite in conformità con le leggi e i codici approvati nel settimo titolo del Regolamento della Legge Sanitaria Generale sulla Ricerca Sanitaria del Governo Messicano (NOM-062-ZOO-1999) e in conformità con le raccomandazioni del National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Experimental Animals e sono state approvate dal comitato istituzionale di bioetica nella ricerca dell'Universidad de Guanajuato e della Benemérita Universidad Autónoma de Puebla.
1. Impostazioni del microscopio
<ol><li>Accendere il sistema di microscopia.</li>
	<li>Accendere il laser pulsato per garantire che sia pronto per il lase a un livello di potenza ottimale e costante dopo l'estrazione e la preparazione del campione.</li>
	<li>Sintonizzare il laser su 810 nm. Per studiare i microtubuli tissular, viene utilizzato il 10% -20% della potenza laser disponibile, che, nel sistema descritto, corrisponde a 13-26 mW misurati sul piano focale posteriore dell'obiettivo.</li>
	<li>Assicurarsi che il microscopio sia allineato a Köhler (file supplementare 1), con l'obiettivo che verrà utilizzato per l'imaging SHG. NOTA: Questo è importante poiché, nella configurazione commerciale utilizzata in questo lavoro, il rilevamento viene eseguito in modalità di trasmissione e attraverso il condensatore.</li>
	<li>Rimuovere i filtri indesiderati dal percorso di rilevamento ottico (Figura 1A).</li>
	<li>Assicurarsi che il diaframma del condensatore sia completamente aperto per garantire che nessuna luce venga interrotta inutilmente a questo livello.</li>
	<li>Preparare un obiettivo ad immersione in olio con apertura numerica (NA) 25x/0,8 con una piccola goccia di olio ad immersione nell'obiettivo. NOTA: Questo obiettivo è stato utilizzato per abbinare al meglio il condensatore NA, che era 0,55 (idealmente, NAcond≥ NAobj).</li>
</ol>2. Controlli preliminari al microscopio
NOTA: eseguire i controlli preliminari del microscopio una volta, a meno che l'impostazione non venga modificata.
<ol><li>Immagine di amido di mais secco inserito tra vetrini con parametri SHG per generare immagini SHG che rivelano la direzione della polarizzazione laser. Seguire i passaggi riportati nel file supplementare 2, ad eccezione della potenza laser, che è inferiore al 5% per l'amido di mais.</li>
	<li>Prendi un'immagine di grani di amido di mais sparsi e segna l'orientamento dei lobuli SHG nel piano x-y. Questo orientamento corrisponde all'orientamento del laser (Figura 2A).</li>
	<li>Come controllo, prendere un'altra immagine dello stesso campione, inserendo nel percorso ottico una piastra a mezza onda (posizione mostrata in Figura 1A) per alterare la direzione di oscillazione del laser. L'immagine risultante mostra lobuli di segnale SHG ruotati (Figura 2B, C).</li>
	<li>Se si utilizza un diverso tipo di filtro passa banda per l'SHG, assicurarsi che abbia proprietà di trasmissione ottimali confrontando le immagini (Figura 2D, E) e le intensità del segnale pixel per pixel lungo una scansione lineare (Figura 2F).</li>
</ol>3. Estrazione dei tessuti
NOTA: Utilizzare sempre strumenti puliti per eseguire le procedure chirurgiche.
<ol><li>Utilizzare ratti taiep di 6-12 mesi e controlli Sprague-Dawley (WT) di età corrispondente.</li>
	<li>Anestetizzare gli animali con un'iniezione endovenosa di una miscela di ketamina-xilazina (0,125 mg/Kg e 5 mg/Kg) diluita in una soluzione sterile di NaCl allo 0,9%.<ol><li>Controlla i riflessi del dolore e procedi solo se sono assenti.</li>
	</ol></li>
	<li>Sacrifica l'animale tramite decapitazione.</li>
	<li>Una volta isolata la testa, aprire attentamente le ossa della volta cranica lungo la linea mediana, partendo dal punto più caudale in alto verso il naso, dalle cavità orbitali verso la linea mediana, e poi dal punto più caudale fino a sotto il cervello e il cervelletto. NOTA: I tagliatori ossei e i Rongeurs consentono una corretta rimozione delle ossa della testa senza danneggiare le strutture cerebrali.</li>
	<li>Rilascia il cervello e il cervelletto dall'osso. I due emisferi potrebbero essere separati. Se gli emisferi sono divisi, utilizzare una metà per l'imaging SHG e fissare l'altra metà in paraformaldeide al 3,7% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 20 minuti all'interno di una cappa chimica per il successivo sezionamento e colorazione.</li>
</ol>4. Sezionamento della vibratoma
<ol><li>Preparare un vassoio tampone vibratome riempito con la soluzione salina bilanciata (HBSS) calda (37 °C) di Hank.</li>
	<li>Fissare il cervello alla piastra del campione usando colla cianoacrilica tramite un pezzo di nastro adesivo. La porzione / regione più caudale entra in contatto con la colla in modo che le sezioni coronali utilizzabili dalla porzione opposta, rostrale, possano essere tagliate.<ol><li>Lasciare ~10 s per polimerizzare la colla per ottenere un attacco efficace del campione. NOTA: I migliori risultati si ottengono quando il cervello è orientato in modo che la lama tagli "dall'alto verso il basso" piuttosto che "da un lato all'altro" (Figura 1B).</li>
	</ol></li>
	<li>Trasferire la piastra del campione sul suo supporto magnetico all'interno del vassoio tampone.</li>
	<li>Inizia a tagliare sezioni da 300-500 μm fino a quando le fette prodotte comprendono l'intera superficie del cervello.</li>
	<li>A questo punto, ridurre lo spessore della sezione a 160 μm.</li>
	<li>Una volta tagliata una sezione completa di 160 μm a livello del corpo calloso, recuperarla con una pipetta Pasteur in vetro modificato con un grande orifizio fiammato (Figura 1C).</li>
	<li>Trasferirlo in una capsula di Petri pulita con un nuovo HBSS caldo o direttamente sul supporto di vetro per microscopia (coprivetrino o piatto con fondo di vetro). NOTA: Per le condizioni sperimentali descritte, l'aggiunta di un coprivetrino sopra il campione è dannosa per l'imaging.</li>
</ol>5. Trasferimento al microscopio
<ol><li>Se il microscopio si trova in una stanza diversa, preparare una scatola isolata con confezioni di gel riscaldate per trasferire le sezioni di tessuto mantenendo la temperatura. La scatola serve anche a mantenere le sezioni calde fino a quando non vengono visualizzate.</li>
	<li>Mettere il campione al microscopio e assicurarsi che sia posizionato correttamente sotto l'obiettivo mediante osservazione diretta attraverso gli oculari con luce trasmessa. NOTA: L'obiettivo è quello di allineare le strutture di emissione previste con la direzione di oscillazione del laser per massimizzare il segnale SHG emesso (e, quindi, rilevato).</li>
	<li>Rimuovere l'HBSS in eccesso in modo che un sottile film liquido copra l'intero campione. Controllare visivamente il film liquido ogni pochi minuti per evitare un'eccessiva evaporazione e asciugatura del campione. NOTA: Nelle condizioni descritte, una sezione viene utilizzata per non più di 20 minuti. L'essiccazione del campione provoca drastici effetti artefici (figura supplementare 1A). Piuttosto che aggiungere più HBSS, si consiglia di immergere periodicamente la sezione in un mezzo caldo e fresco se sono necessari tempi di imaging più lunghi. L'uso di camere di perfusione e colla o agarosio a basso punto di fusione per immobilizzare il tessuto è raccomandato anche quando devono essere fatti esperimenti più lunghi.</li>
	<li>Preparare la fase del microscopio per l'imaging non scansionato, che potrebbe includere la chiusura di tutte le porte della camera di incubazione buia o la copertura della camera di incubazione con un tessuto rivestito in poliuretano di nylon nero.</li>
</ol>6. Imaging
<ol><li>Selezionare la modalità di imaging "non scansionata" lungo il percorso di trasmissione. In questo modo, la cattura del debole segnale SH della tubulina sarà ottimizzata.</li>
	<li>Selezionare l'obiettivo LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA.</li>
	<li>Imposta una potenza laser compresa tra 13 mW e 26 mW, con un tempo di permanenza dei pixel di 12,6 μs. Scatta immagini non più grandi di 512 pixel x 512 pixel, con velocità 5 e media di 2, per un tempo medio di acquisizione di circa 15 s. NOTA: L'utilizzo di potenze laser più elevate e/o tempi di permanenza più lunghi può danneggiare il campione (Figura supplementare 1B).</li>
	<li>Scatta prima le immagini utilizzando un filtro passa-corto da 485 nm (SP485) e, in una seconda fase, aggiungi un filtro passa banda nitido da 405 nm (BP405; Figura 3). Seguire i passaggi riportati nel file supplementare 2. NOTA: Le immagini pseudo-in campo chiaro possono essere prese attraverso lo stesso rivelatore utilizzando la luce laser residua di una linea visibile (i laser a 405 nm o 488 nm funzionano meglio).</li>
</ol>7. Lavorazione del cervelletto
<ol><li>Per prima cosa, tagliare il cervelletto con un bisturi in due emisferi, quindi incollarli al supporto del vibratomo dalla parte centrale (la parte piatta ottenuta dopo il taglio).</li>
	<li>Sezione e immagine del cervelletto nello stesso modo descritto per il cervello (sezioni da 160 μm, stesse impostazioni di vibratomo, stessa lama, stesse impostazioni del microscopio, ecc.). NOTA: A causa dell'anatomia del cervelletto, il suo orientamento al momento del sezionamento non è critico; Nella maggior parte delle fette generate lontano dalla superficie, ci saranno folia sezionati bene nella sostanza bianca.</li>
</ol>

<ol><li>Palmiter, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+ablation+in+transgenic+mice+by+cell-specific+expression+of+a+toxin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene.</a> Cell. 50 (3), 435-443 (1987).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monoclonal+antibody+against+the+type+II+isotype+of+beta-tubulin.+Preparation+of+isotypically+altered+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A monoclonal antibody against the type II isotype of beta-tubulin. Preparation of isotypically altered tubulin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 263 (6), 3029-3034 (1988).</li>
<li>Banerjee, A., Roach, M. C., Trcka, P., Luduena, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+monoclonal+antibody+specific+for+the+class+IV+isotype+of+beta-tubulin.+Purification+and+assembly+of+alpha+beta+II%2C+alpha+beta+III%2C+and+alpha+beta+IV+tubulin+dimers+from+bovine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin. Purification and assembly of alpha beta II, alpha beta III, and alpha beta IV tubulin dimers from bovine brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (8), 5625-5630 (1992).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+%CE%B2v+tubulin+in+the+cochlea+and+cultured+cells+with+a+novel+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Localization of βv tubulin in the cochlea and cultured cells with a novel monoclonal antibody.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 505-514 (2008).</li>
<li>Cross, A. R., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinky+microtubules%3A+Bending+and+breaking+induced+by+fixation+in+vitro+with+glutaraldehyde+and+formaldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Kinky microtubules: Bending and breaking induced by fixation in vitro with glutaraldehyde and formaldehyde.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 20 (4), 272-278 (1991).</li>
<li>Van Steenbergen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+understanding+of+label-free+second+harmonic+imaging+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Molecular understanding of label-free second harmonic imaging of microtubules.</a> Nature Communications. 10 (1), 3530(2019).</li>
<li>Campagnola, P. J., Clark, H. A., Mohler, W. A., Lewis, A., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-harmonic+imaging+microscopy+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Second-harmonic imaging microscopy of living cells.</a> Journal of Biomedical Optics. 6 (3), 277(2001).</li>
<li>Campagnola, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+second-harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).</li>
<li>Yu, C. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+microtubule+polarity+in+spindles+with+second-harmonic+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measuring microtubule polarity in spindles with second-harmonic generation.</a> Biophysical Journal. 106 (8), 1578-1587 (2014).</li>
<li>Bancelin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+microtubules+polarity+in+mitotic+spindles+in+situ+using+Interferometric+Second+Harmonic+Generation+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Probing microtubules polarity in mitotic spindles in situ using Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy.</a> Scientific Reports. 7, 6758(2017).</li>
<li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+polarity+microtubule+assemblies+imaged+in+native+brain+tissue+by+second-harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Uniform polarity microtubule assemblies imaged in native brain tissue by second-harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7081-7086 (2003).</li>
<li>Psilodimitrakopoulos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+effective+orientation+of+the+SHG+source+in+primary+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Estimation of the effective orientation of the SHG source in primary cortical neurons.</a> Optics Express. 17 (16), 14418(2009).</li>
<li>Sharoukhov, D., Bucinca-Cupallari, F., Lim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+imaging+reveals+cytoskeletal+deficit+predisposing+the+retinal+ganglion+cell+axons+to+atrophy+in+DBA%2F2J%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Opthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Microtubule imaging reveals cytoskeletal deficit predisposing the retinal ganglion cell axons to atrophy in DBA/2J.</a> Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (13), 5292(2018).</li>
<li>Alata, M., Piazza, V., Eguibar, J. R., Cortes, C., Hernandez, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H-ABC+tubulinopathy+revealed+by+label-free+second+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">H-ABC tubulinopathy revealed by label-free second harmonic generation microscopy.</a> Scientific Reports. 12, 14417(2022).</li>
<li>Duncan, I. D., Lunn, K. F., Holmgren, B., Urba-Holmgren, R., Brignolo-Holmes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+taiep+rat%3A+A+myelin+mutant+with+an+associated+oligodendrocyte+microtubular+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">The taiep rat: A myelin mutant with an associated oligodendrocyte microtubular defect.</a> Journal of Neurocytology. 21 (12), 870-884 (1992).</li>
<li>Duncan, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+the+Tubb4a+gene+leads+to+microtubule+accumulation+with+hypomyelination+and+demyelination%3A+Tubb4a+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">A mutation in the Tubb4a gene leads to microtubule accumulation with hypomyelination and demyelination: Tubb4a Mutation.</a> Annals of Neurology. 81 (5), 690-702 (2017).</li>
<li>Garduno-Robles, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+features+in+a+rat+model+of+H-ABC+tubulinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 555(2020).</li>
<li>Lopez-Juarez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+impairment+in+H-ABC+tubulinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Auditory impairment in H-ABC tubulinopathy.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (5), 957-968 (2021).</li>
<li>Alata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+evaluation+of+cerebellar+signs+of+H-ABC+tubulinopathy+in+a+patient+and+in+the+taiep+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model.</a> Frontiers in Neurology. 12, 702039(2021).</li>
<li>Parodi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+microscopy%3A+From+fundamentals+to+applications+in+live+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical microscopy: From fundamentals to applications in live bioimaging.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 585363(2020).</li>
<li>Lefort, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+biomedical+multiphoton+microscopy+and+its+laser+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (42), 423001(2017).</li>
<li>Campagnola, P. J., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-harmonic+imaging+microscopy+for+visualizing+biomolecular+arrays+in+cells%2C+tissues+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms.</a> Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).</li>
<li>vander Knaap, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+syndrome+characterized+by+hypomyelination+with+atrophy+of+the+basal+ganglia+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Neuroradiology%22%5BJournal%5D)">New syndrome characterized by hypomyelination with atrophy of the basal ganglia and cerebellum.</a> American Journal of Neuroradiology. 23 (9), 1466(2002).</li>
<li>Stoller, P., Kim, B. -M., Rubenchik, A. M., Reiser, K. M., Da Silva, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization-dependent+optical+second-harmonic+imaging+of+a+rat-tail+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Polarization-dependent optical second-harmonic imaging of a rat-tail tendon.</a> Journal of Biomedical Optics. 7 (2), 205(2002).</li>
<li>Brown, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+gene+expression%2C+angiogenesis+and+physiological+function+in+tumors+using+multiphoton+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy.</a> Nature Medicine. 7 (7), 864-868 (2001).</li>
<li>Chakraborti, S., Natarajan, K., Curiel, J., Janke, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+tubulin+code%3A+From+the+tubulin+molecule+to+neuronal+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the tubulin code: From the tubulin molecule to neuronal function and disease.</a> Cytoskeleton. 73 (10), 521-550 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

La microscopia SHG fa parte di un gruppo di tecniche di ottica non lineare, che includono la microscopia a eccitazione a due fotoni, la microscopia a generazione di terza armonica e la microscopia a diffusione Raman anti-Stokes coerente, che hanno contribuito ad ampliare la gamma di applicazioni della microscopia ottica convenzionale alle scienze della vita20.
In particolare, la maggiore forza e debolezza della microscopia SHG si riferiscono alla stessa condizione: il g...

L'imaging ottico delle strutture citoscheletriche nei tessuti e nei preparati di organi non è un compito facile. I filamenti citoscheletrici sono onnipresenti, quindi se viene eseguita una colorazione generica, ad esempio, contro alfa-tubulina o beta-actina o potenzialmente cheratina in un campione epiteliale, il segnale sarà probabilmente distribuito in modo piuttosto omogeneo su tutto il campione. Per limitare la colorazione a un sottoinsieme più significativo di componenti cellulari, è possibile utilizzare topi transgenici con espressione mirata1 o pianificare l'uso di anticorpi isoforma-specifici. Mentre pochissimi di questi ultimi sono sul mercato (e pochissimi esistono affatto 2,3,4), potrebbe essere disponibile un modello animale transgenico. Tuttavia, deve essere acquisito dal laboratorio e adeguatamente alloggiato, con tutte le spese coinvolte nel processo. Alcuni anticorpi o sostanze chimiche, ad esempio i farmaci coniugati con fluorofori come la falloidina o il paclitaxel, possono essere parzialmente o totalmente incompatibili con l'uso in cellule o tessuti viventi, limitando così la loro applicabilità ai soli studi su campioni fissi.
Nel caso della tubulina, un ulteriore aspetto deve essere preso in considerazione, ovvero la sensibilità del polimero alla fissazione. La fissazione chimica convenzionale con la formaldeide è nota per non essere adeguata a preservare in modo ottimale l'integrità dei microtubuli5. Inoltre, un recente rapporto conferma che la reticolazione della formaldeide induce sottili cambiamenti nell'ultrastruttura del microtubulo, simile a quanto accade con il legame di alcuni farmaci o molecole fisiologiche come GTP6.
La visualizzazione diretta di microtubuli in campioni non colorati e non fissati è, quindi, spesso auspicabile. Per raggiungere questo obiettivo, una soluzione tecnica è la microscopia di seconda generazione armonica (SHG)7, che si basa sulla capacità di fasci di microtubuli paralleli di agire come monofori e di emettere luce raddoppiata in frequenza quando adeguatamente illuminati con un intenso laser a infrarossi pulsato. Sebbene un secondo segnale armonico più forte e più stabile possa essere generato dal collagene e dalla miosina, che sono gli unici altri due materiali biologici noti per essere in grado di raddoppiare la frequenza, il segnale della tubulina è stato finora utilizzato principalmente per studiare i riarrangiamenti del fuso mitotico 8,9,10 e la morfologia dei microtubuli assonali11,12,13.
In questo lavoro, introduciamo un nuovo uso della microscopia SHG come strumento diagnostico per distinguere i tessuti del sistema nervoso centrale (SNC) affetti da tubulopatia beta 4 A (TUBB4A) dalle loro controparti sane14. Alcune delle mutazioni che si verificano in questa isoforma prevalentemente neurale della tubulina, come quelle che causano l'ipomielinizzazione e l'atrofia dei gangli della base e del cervelletto (H-ABC), inducono un riempimento eccessivo di microtubuli negli oligodendrociti15,16; Le alterazioni citoscheletriche, a loro volta, sono associate ad effetti a valle come la dismielinizzazione, con profonda compromissione delle vie motorie e sensoriali16,17,18,19. Il modello murino taiep utilizzato in questo lavoro mostra un contenuto anormale di microtubuli negli oligodendrociti e ricapitola la maggior parte dei sintomi senso-motori dei pazienti con H-ABC17. Il protocollo spiega come visualizzare strutture come il corpo calloso e il cervelletto, che di solito sono altamente mielinizzati e che sono gravemente colpiti nei pazienti umani e nel ratto taiep 19, per evidenziare le differenze nei segnali SH tra tessuti sani e mutanti.

<table><tbody><tr><td>Filtro passa-banda a banda singola BrightLine® 405/10 nm&nbsp;</td><td>Semrock</td><td>FF01-405/10-25</td><td>Diametro 32 mm, con anello di alloggiamento</td></tr><tr><td>nylon nero, tessuto spalmato in poliuretano</td><td>Thorlabs</td><td>BK5</td><td>5' x 9' (1,5 m x 2,7 m) x 0,005" (0,12 mm) di spessore&nbsp;</td></tr><tr><td>Lame per vibratomo</td><td>qualsiasi pubblicità; ad es. Spada Wilkinson</td><td></td><td>&nbsp; Classiche lame di rasoio a doppio taglio in acciaio inossidabile</td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari, 35 mm</td><td>qualsiasi pubblicità; ad esempio Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Zeiss</td><td>LSM710NLO AxioObserver Z1</td><td>Microscopio invertito, l'obiettivo utilizzato è LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA&nbsp;</td></tr><tr><td>Più fresco</td><td>qualsiasi pubblicità</td><td></td><td>Qualsiasi scatola isolata in polistirolo potrebbe funzionare, per mantenere il campione a circa 37 gradi; C</td></tr><tr><td>Sacca di mais</td><td>ad esempio Maizena</td><td></td><td>Dal supermercato</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti #1.5</td><td>qualsiasi pubblicità</td><td></td><td>Rettangolare</td></tr><tr><td>Colla cianoacrilica</td><td>ad es. Loctite</td><td></td><td>Per incollare il cervello al nastro adesivo</td></tr><tr><td>Pinze fini</td><td>strumenti scientifici raffinati</td><td>11412-11</td><td>Manipolare sezioni di tessuto mediante manipolazione dalle meningi</td></tr><tr><td>Forbici fini</td><td>strumenti scientifici raffinati</td><td>14370-22</td><td>Per tagliare la pelle&nbsp;</td></tr><tr><td>Forbici fini punta curva</td><td>strumenti scientifici raffinati</td><td>14061-09</td><td>Per tagliare lungo la linea mediana</td></tr><tr><td>Formaldeide 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>Per diluire 1:10 in PBS</td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>strumenti scientifici raffinati</td><td>16000-14</td><td>Per tagliare l'osso</td></tr><tr><td>Impacchi di gel</td><td>qualsiasi pubblicità</td><td></td><td>Preriscaldato a 37 gradi C, per aiutare a mantenere la temperatura all'interno del refrigeratore</td></tr><tr><td>Pipetta in vetro Pasteur, modificata</td><td>qualsiasi pubblicità</td><td></td><td>Per trasferire la sezione di tessuto</td></tr><tr><td>Hanks&prime; Soluzione salina bilanciata (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-076</td><td>Potrebbe essere preparato da polveri</td></tr><tr><td>Emostatici di Kelly</td><td>strumenti scientifici raffinati</td><td>13018-14</td><td>Per separare l'osso&nbsp;</td></tr><tr><td>Nastro adesivo</td><td>qualsiasi pubblicità</td><td></td><td>Per proteggere la superficie della piastra del campione</td></tr><tr><td>Modulo NDD, tipo C</td><td>Zeiss</td><td>000000-1410-101</td><td>Per rilevare il segnale, riducendo la perdita di luce. Alloggiamento del set di filtri 000000-1935-163 con l'SP485</td></tr><tr><td>Tronchesi ossei offset</td><td>strumenti scientifici raffinati</td><td>16101-10</td><td>Per tagliare l'osso</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td>Potrebbe essere preparato da polveri o pastiglie</td></tr><tr><td>Laser pulsato</td><td>Coerente</td><td>Visione del camaleonte II</td><td>680&ndash; Laser sintonizzabile da 1080 nm</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>qualsiasi pubblicità</td><td></td><td>Lama dritta con punta affilata</td></tr><tr><td>Pinze standard</td><td>strumenti scientifici raffinati</td><td>11000-18</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla Vannas</td><td>strumenti scientifici raffinati</td><td>15018-10</td><td>Per tagliare le meningi che rimangono unite sia alla fetta ottenuta dal taglio a vibratomo che alla sezione incollata alla piastra del provino.</td></tr><tr><td>Vibratomo</td><td>qualsiasi pubblicità; ad es. Leica</td><td>VT1200</td><td></td></tr></tbody></table>

ottica non lineare label-free per lo studio dei difetti tubulina-dipendenti nella mielina centrale

Label-Free Non-Linear Optics for the Study of Tubulin-Dependent Defects in Central Myelin

La visualizzazione soddisfacente dei componenti citoscheletrici nel cervello è impegnativa. La distribuzione ubiquitaria delle reti di microtubuli, microfilamenti e filamenti intermedi in tutti i tessuti neurali, insieme alla variabilità negli esiti delle strategie di fusione delle proteine fluorescenti e alla loro limitata applicabilità agli studi dinamici di anticorpi e farmaci come veicoli cromofori, rendono gli approcci ottici classici non efficaci come per altre proteine. Quando la tubulina deve essere studiata, la generazione label-free di seconde armoniche è un'opzione molto adatta a causa dell'organizzazione non centrosimmetrica della molecola. Questa tecnica, quando coniugata alla microscopia, può descrivere qualitativamente la distribuzione volumetrica di fasci paralleli di microtubuli in campioni biologici, con l'ulteriore vantaggio di lavorare con tessuti freschi non fissati e non permeabilizzati. Questo lavoro descrive come visualizzare la tubulina con una configurazione commerciale di microscopia di seconda generazione armonica per evidenziare i microtubuli nelle strutture arricchite di tubulina degli oligodendrociti, come nell'ipomielinizzazione con atrofia dei gangli della base e della tubulopatia del cervelletto (H-ABC), un disturbo mielinico recentemente descritto.

Le immagini ottenute con questa metodologia hanno un livello di fondo intrinsecamente basso a causa del numero molto limitato di armonofori presenti nei tessuti biologici, che è uno dei vantaggi significativi del metodo.
Quando vengono visualizzate le fibre del corpo calloso, strutture corte simili a fibre ed elementi arrotondati possono essere trovati costantemente nel cervello taiep (Figura 3B), mentre il corpo calloso del cervello di controllo mostra un segnale molto più eterogeneo...

In questo articolo, presentiamo un protocollo per rilevare oligodendrociti caricati con microtubuli in un modello di tubulopatia attraverso un approccio di microscopia di seconda generazione armonica semplice e innovativo.

Ottica non lineare label-free per lo studio dei difetti tubulina-dipendenti nella mielina centrale

The satisfactory visualization of cytoskeletal components in the brain is challenging. The ubiquitous distribution of the networks of microtubules, ...

L'imaging di seconda generazione armonica di campioni biologici è una tecnica ottica che consente la visualizzazione di molecole non centrosimmetriche e dei loro assemblaggi senza la necessità di un tag o di un colorante. Le immagini generate con questo metodo hanno un basso sfondo poiché pochissime molecole biologiche potrebbero agire come una forza harmonale. Questo protocollo descrive l'applicazione della tecnica per la diagnostica per immagini della tubulina beta-4A nel modello animale taiep.Le tubulinopatie sono malattie descritte di recente. Per questo motivo, è disponibile una quantità limitata di informazioni sui meccanismi di base alla base della fisiopatologia a livello cellulare. Per iniziare, accendi il laser a impulsi per garantire che sia pronto a raggiungere un livello di potenza ottimale e costante.Per studiare i microtubuli tissular, viene utilizzato dal 10 al 20% della potenza laser disponibile, che nel sistema descritto corrisponde a 13-26 milliwatt misurati sul piano focale posteriore dell'obiettivo. Prima dell'imaging, ruotare il laser a 810 nanometri. Quindi assicurarsi che il microscopio sia allineato a Koehler con l'obiettivo utilizzato per la seconda generazione armonica o l'imaging SHG.Rimuovere i filtri indesiderati dal percorso di rilevamento ottico e assicurarsi che il diaframma del condensatore sia completamente aperto e che la luce non venga interrotta inutilmente. Prepara un obiettivo ad immersione dell'olio con apertura numerica 25x x 0,8 con una piccola goccia di olio ad immersione nell'obiettivo. Seguendo i passaggi riportati nella tabella qui, ad eccezione della potenza laser che è inferiore al 5% per l'amido di mais.Immagine amido di mais secco inserito tra diapositive di vetro. con i parametri SHG per generare immagini SHG, rivelano la direzione di polarizzazione del laser. Cattura un'immagine di grani di amido di mais sparsi e segna l'orientamento dei lobuli SHG nel piano XY corrispondente all'orientamento della polarizzazione laser.Per il controllo, scatta un'altra immagine dello stesso campione inserendo una piastra a mezza onda nel percorso ottico per alterare la direzione di oscillazione del laser. L'immagine risultante mostra i lobuli di segnale SHG ruotati. Se si utilizza un filtro passa banda diverso per l'SHG, assicurarsi che abbia proprietà di trasmissione ottimali confrontando le immagini e le intensità del segnale pixel per pixel lungo la linea di scansione.Preparare un vassoio tampone vibratome riempito con una soluzione salina bilanciata di Hanks calda o HBSS. Fissare il cervello alla piastra del campione usando colla cianoacrilica tramite un pezzo di nastro adesivo. La porzione più caudale contatta la colla in modo che le sezioni coronali utilizzabili dalla porzione rostrale opposta possano essere tagliate.Trasferire la piastra del campione sul suo supporto magnetico all'interno del vassoio tampone. Inizia a tagliare sezioni da 300 a 500 micron fino a quando le fette comprendono l'intera superficie del cervello. Quindi ridurre lo spessore della sezione a 160 micron.Una volta tagliata una sezione di 160 micron a livello del corpo calloso, recuperarla con una pipetta Pasteur in vetro modificato con un grande orifizio flangiato. Trasferire la sezione in una capsula di Petri pulita con un nuovo HBSS caldo o direttamente sul vetrino di copertura o sul piatto inferiore in vetro per la microscopia. Posizionare il campione al microscopio e posizionarlo opportunamente sotto l'obiettivo mediante osservazione diretta attraverso gli oculari con luce trasmessa.Rimuovere l'HBSS in eccesso in modo che un sottile film liquido copra l'intero campione. Controllare visivamente il film liquido ogni pochi minuti per evitare un'eccessiva evaporazione e asciugatura del campione. Preparare la fase del microscopio per l'imaging non descatizzato, che include la chiusura di tutte le porte della camera di incubazione buia o la copertura della camera di incubazione con un tessuto rivestito in poliuretano di nylon nero.Selezionare la modalità di imaging non sottoposta a scansione lungo il percorso di trasmissione. In questo modo, la cattura del debole segnale SH della tubulina sarà ottimizzata. Quindi selezionare l'obiettivo.Quindi, impostare una potenza laser con un tempo di permanenza in pixel di 12,6 microsecondi. Scatta immagini non più grandi di 512 x 512 pixel con velocità cinque e una media di due per un tempo medio di acquisizione di 15 secondi. Acquisisci prima le immagini utilizzando un filtro shortpass a 485 nanometri e, in un secondo passaggio, aggiungi un filtro passa banda nitido a 405 nanometri.Tagliare il cervelletto con un bisturi in due emisferi e fissarli al supporto del vibratomo dalla parte centrale. Sezione e immagine del cervelletto usando le stesse impostazioni di vibratomo, lama e microscopio descritte per il cervello. Quando vengono visualizzate le fibre del corpo calloso, nel cervello taiep si osservano strutture corte simili a fibre ed elementi arrotondati.Al contrario, il corpo calloso del cervello di controllo mostra un segnale molto più eterogeneo e isotropo in tutta la regione del cervello. L'origine del segnale differenziale risiede specificamente nel fenomeno della seconda generazione armonica poiché l'aggiunta del filtro passa-banda stretto diminuisce solo l'intensità del segnale non specifico dalle immagini di controllo, rimuovendo selettivamente questo segnale a bassa diffusione intorno alle strutture simili a soma e allungate corte nelle immagini taiep che generano sempre un'intensa luce SH. Nel tessuto di controllo della sostanza bianca cerebellare, è stata osservata la completa assenza di segnale SH.Le cellule di Purkinje sono appena visibili quando si utilizza il filtro a passaggio corto e le strutture allungate e arrotondate persistono nell'immagine SH dal tessuto taiep. Un passo fondamentale per ottenere l'immagine migliore è tagliare le sezioni di tessuto il più sottili possibile. Inoltre, lavorare con sezioni di tessuto acuto richiede protocolli rapidi per prevenire il deterioramento dei tessuti.Pertanto, è fondamentale impostare e controllare preventivamente il sistema ottico. Il segnale della seconda armonica proveniente dai microtubuli è più debole del segnale della seconda armonica dell'amido. Pertanto, è necessario utilizzare più potenza laser per l'imaging dei microtubuli.La potenza del laser dovrebbe essere aumentata con attenzione perché, poiché per l'imaging viene utilizzato un obiettivo ad alta apertura numerica, l'intensità del campione aumenterebbe rapidamente Con l'imaging di seconda generazione armonica, i cambiamenti patologici nella mielinomatica centrale del modello tubulinopatico sono rapidamente e facilmente identificati. Le potenziali applicazioni di questa tecnica includono il suo utilizzo per lo studio dei meccanismi di base della tubulopatia H-ABC e per la valutazione di terapie farmacologiche per il trattamento dei pazienti. A lungo termine, la tecnica ha il potenziale per diventare uno strumento diagnostico complementare da utilizzare per via intracranica o su biopsie fresche.

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In questo video, descriviamo la tecnica di microscopia a riflessione per interferenza (IRM) per visualizzare i microtubuli che crescono sulla superficie di un vetrino coprioggetti in presenza di un tampone adatto. Dopo l'illuminazione con luce incidente, l'interfaccia vetrino-tampone e l'interfaccia tampone-microtubuli riflettono la luce, che si combina per creare un modello di interferenza, consentendo la visualizzazione dei microtubuli come immagini ad alto contrasto su uno sfondo luminoso.

Microscopia a riflessione interferenziale per la visualizzazione senza marcatura della dinamica dei microtubuli

Fonte: Piazza, V., et al., Ottica non lineare senza etichetta per lo studio dei difetti dipendenti dalla tubulina nella mielina centrale. J. Vis. Exp. (2023)Questo video mostra la procedura per l'imaging delle anomalie dei microtubuli in una fetta di tessuto cerebrale di ratto utilizzando un microscopio a eccitazione a due fotoni. Impiega segnali di seconda armonica (SHG) per rilevare i difetti della tubulina e la ridotta produzione di mielina.

Imaging di seconda generazione armonica in un modello di ratto per studiare i difetti della tubulina

Presentiamo un protocollo che utilizza la microscopia time-lapse con eccitazione a due fotoni per visualizzare simultaneamente la dinamica delle lesioni degli assoni e della mielina in tempo reale. Questo protocollo proposto consente di studiare fattori sia intrinseci che estrinseci che possono influenzare il destino dell'assone mielinizzato centrale dopo una lesione e contribuire alla disabilità clinica permanente.

Un Ex Vivo Laser-indotta Spinal Cord Injury modello per valutare i meccanismi di degenerazione assonale in tempo reale

Immunolabeling metodi per analizzare popolazioni distinte dei microtubuli in zebrafish sviluppo del cervello sono descritti qui, che sono ampiamente applicabili ad altri tessuti. Il primo protocollo delinea un metodo ottimizzato per immunolabeling stabile e dinamica dei microtubuli. Il secondo protocollo fornisce un metodo per immagine e quantificare i microtubuli nascenti in particolare.

Uso di Immunolabeling per analizzare i microtubuli stabili, dinamici e nascenti nell'embrione di pesce zebra

Qui, presentiamo un protocollo passo-passo per l'imaging di assoni myelinated in una fetta di cervello fisso utilizzando una scala nanometrica privo di etichetta tecnica basato su riflettometria spettrale di imaging.

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Qui presentiamo un metodo robusto e dettagliato di analisi delle dinamiche dei microtubuli nelle cellule sincronizzate nella prometafase utilizzando la microscopia confocale del disco di filatura a cellule vive e l'elaborazione delle immagini basata su MATLAB.

Misurazione della microtubule Dynamics mediante microscopia disco rotante in spindle mitotici monopolari

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