Ottica non lineare label-free per lo studio dei difetti tubulina-dipendenti nella mielina centrale

L'imaging di seconda generazione armonica di campioni biologici è una tecnica ottica che consente la visualizzazione di molecole non centrosimmetriche e dei loro assemblaggi senza la necessità di un tag o di un colorante. Le immagini generate con questo metodo hanno un basso sfondo poiché pochissime molecole biologiche potrebbero agire come una forza harmonale. Questo protocollo descrive l'applicazione della tecnica per la diagnostica per immagini della tubulina beta-4A nel modello animale taiep.

Le tubulinopatie sono malattie descritte di recente. Per questo motivo, è disponibile una quantità limitata di informazioni sui meccanismi di base alla base della fisiopatologia a livello cellulare. Per iniziare, accendi il laser a impulsi per garantire che sia pronto a raggiungere un livello di potenza ottimale e costante.

Per studiare i microtubuli tissular, viene utilizzato dal 10 al 20% della potenza laser disponibile, che nel sistema descritto corrisponde a 13-26 milliwatt misurati sul piano focale posteriore dell'obiettivo. Prima dell'imaging, ruotare il laser a 810 nanometri. Quindi assicurarsi che il microscopio sia allineato a Koehler con l'obiettivo utilizzato per la seconda generazione armonica o l'imaging SHG.

Rimuovere i filtri indesiderati dal percorso di rilevamento ottico e assicurarsi che il diaframma del condensatore sia completamente aperto e che la luce non venga interrotta inutilmente. Prepara un obiettivo ad immersione dell'olio con apertura numerica 25x x 0,8 con una piccola goccia di olio ad immersione nell'obiettivo. Seguendo i passaggi riportati nella tabella qui, ad eccezione della potenza laser che è inferiore al 5% per l'amido di mais.

Immagine amido di mais secco inserito tra diapositive di vetro. con i parametri SHG per generare immagini SHG, rivelano la direzione di polarizzazione del laser. Cattura un'immagine di grani di amido di mais sparsi e segna l'orientamento dei lobuli SHG nel piano XY corrispondente all'orientamento della polarizzazione laser.

Per il controllo, scatta un'altra immagine dello stesso campione inserendo una piastra a mezza onda nel percorso ottico per alterare la direzione di oscillazione del laser. L'immagine risultante mostra i lobuli di segnale SHG ruotati. Se si utilizza un filtro passa banda diverso per l'SHG, assicurarsi che abbia proprietà di trasmissione ottimali confrontando le immagini e le intensità del segnale pixel per pixel lungo la linea di scansione.

Preparare un vassoio tampone vibratome riempito con una soluzione salina bilanciata di Hanks calda o HBSS. Fissare il cervello alla piastra del campione usando colla cianoacrilica tramite un pezzo di nastro adesivo. La porzione più caudale contatta la colla in modo che le sezioni coronali utilizzabili dalla porzione rostrale opposta possano essere tagliate.

Trasferire la piastra del campione sul suo supporto magnetico all'interno del vassoio tampone. Inizia a tagliare sezioni da 300 a 500 micron fino a quando le fette comprendono l'intera superficie del cervello. Quindi ridurre lo spessore della sezione a 160 micron.

Una volta tagliata una sezione di 160 micron a livello del corpo calloso, recuperarla con una pipetta Pasteur in vetro modificato con un grande orifizio flangiato. Trasferire la sezione in una capsula di Petri pulita con un nuovo HBSS caldo o direttamente sul vetrino di copertura o sul piatto inferiore in vetro per la microscopia. Posizionare il campione al microscopio e posizionarlo opportunamente sotto l'obiettivo mediante osservazione diretta attraverso gli oculari con luce trasmessa.

Rimuovere l'HBSS in eccesso in modo che un sottile film liquido copra l'intero campione. Controllare visivamente il film liquido ogni pochi minuti per evitare un'eccessiva evaporazione e asciugatura del campione. Preparare la fase del microscopio per l'imaging non descatizzato, che include la chiusura di tutte le porte della camera di incubazione buia o la copertura della camera di incubazione con un tessuto rivestito in poliuretano di nylon nero.

Selezionare la modalità di imaging non sottoposta a scansione lungo il percorso di trasmissione. In questo modo, la cattura del debole segnale SH della tubulina sarà ottimizzata. Quindi selezionare l'obiettivo.

Quindi, impostare una potenza laser con un tempo di permanenza in pixel di 12,6 microsecondi. Scatta immagini non più grandi di 512 x 512 pixel con velocità cinque e una media di due per un tempo medio di acquisizione di 15 secondi. Acquisisci prima le immagini utilizzando un filtro shortpass a 485 nanometri e, in un secondo passaggio, aggiungi un filtro passa banda nitido a 405 nanometri.

Tagliare il cervelletto con un bisturi in due emisferi e fissarli al supporto del vibratomo dalla parte centrale. Sezione e immagine del cervelletto usando le stesse impostazioni di vibratomo, lama e microscopio descritte per il cervello. Quando vengono visualizzate le fibre del corpo calloso, nel cervello taiep si osservano strutture corte simili a fibre ed elementi arrotondati.

Al contrario, il corpo calloso del cervello di controllo mostra un segnale molto più eterogeneo e isotropo in tutta la regione del cervello. L'origine del segnale differenziale risiede specificamente nel fenomeno della seconda generazione armonica poiché l'aggiunta del filtro passa-banda stretto diminuisce solo l'intensità del segnale non specifico dalle immagini di controllo, rimuovendo selettivamente questo segnale a bassa diffusione intorno alle strutture simili a soma e allungate corte nelle immagini taiep che generano sempre un'intensa luce SH. Nel tessuto di controllo della sostanza bianca cerebellare, è stata osservata la completa assenza di segnale SH.

Le cellule di Purkinje sono appena visibili quando si utilizza il filtro a passaggio corto e le strutture allungate e arrotondate persistono nell'immagine SH dal tessuto taiep. Un passo fondamentale per ottenere l'immagine migliore è tagliare le sezioni di tessuto il più sottili possibile. Inoltre, lavorare con sezioni di tessuto acuto richiede protocolli rapidi per prevenire il deterioramento dei tessuti.

Pertanto, è fondamentale impostare e controllare preventivamente il sistema ottico. Il segnale della seconda armonica proveniente dai microtubuli è più debole del segnale della seconda armonica dell'amido. Pertanto, è necessario utilizzare più potenza laser per l'imaging dei microtubuli.

La potenza del laser dovrebbe essere aumentata con attenzione perché, poiché per l'imaging viene utilizzato un obiettivo ad alta apertura numerica, l'intensità del campione aumenterebbe rapidamente Con l'imaging di seconda generazione armonica, i cambiamenti patologici nella mielinomatica centrale del modello tubulinopatico sono rapidamente e facilmente identificati. Le potenziali applicazioni di questa tecnica includono il suo utilizzo per lo studio dei meccanismi di base della tubulopatia H-ABC e per la valutazione di terapie farmacologiche per il trattamento dei pazienti. A lungo termine, la tecnica ha il potenziale per diventare uno strumento diagnostico complementare da utilizzare per via intracranica o su biopsie fresche.