Screening genetico per l'identificazione di soppressori multicopia in Schizosaccharomyces pombe

Gli schermi soppressori identificano le interazioni genetiche che farebbero luce sulle funzioni del gene di interesse, nonché sui percorsi e sui processi biologici in cui possono essere coinvolti in vivo. Questa tecnica può identificare una relazione genetica tra due prodotti genici che potrebbero non essere stati dimostrati utilizzando altri approcci. I risultati di tali screening nel lievito possono essere estesi agli organismi eucarioti elevati, poiché la maggior parte dei percorsi e dei processi biologici fondamentali sono conservati attraverso l'evoluzione.

Il successo dello schema dipende dalla disponibilità, dall'alta qualità e dall'elevata efficienza della sua trasformazione in cellule di lievito. Quindi, protocollo di trasformazione con il plasmide prima di Crescere il ceppo di delezione Schizosaccharomyces pombe ell1 a 32 gradi Celsius su piastra media YE. Prelevare un cappio pieno di ceppo mutante ell1 dalla piastra, inoculare cinque millilitri di terreno YE integrato, quindi incubare la fiala agitando a 32 gradi Celsius durante la notte.

Dopo l'incubazione, diluire la coltura di crescita durante la notte in 100 millilitri di terreno YE fresco contenente gli integratori desiderati per ottenere una densità ottica di 0,3 a 600 nanometri. Incubare il mezzo a 32 gradi Celsius agitando a 200-550 RPM fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge la fase intermedia. Dopo aver diviso i 100 millilitri di coltura in due provette da centrifuga da 50 millilitri, pellettare le cellule a 4.000 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente.

Una volta scartato il surnatante risospendere il pellet cellulare in un millilitro di acqua sterile. Centrifugare e scartare nuovamente il surnatante e quindi risospendere il pellet cellulare in un millilitro di acetato di litio TE. Pellettare la cella mediante centrifugazione e risospendere ogni pellet di cella in 250 microlitri di acetato di litio TE. Successivamente, trasferire 125 microlitri delle cellule competenti in quattro diverse provette sterili di microcentrifuga per le successive fasi di trasformazione. Far bollire il DNA del vettore dai testicoli di salmone o dallo sperma di aringa per un minuto e posizionare immediatamente il tubo sul ghiaccio.

Per ogni trasformazione, aggiungere 10 microlitri di DNA portante a singolo filamento alla provetta della microcentrifuga contenente 125 microlitri delle cellule competenti e mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Successivamente, aggiungere 50 microgrammi della libreria di cDNA Schizosaccharomyces pombe alla provetta contenente cellule competenti e miscela di DNA vettore. Dopo aver incubato il tubo a temperatura ambiente per 10 minuti, aggiungere 260 microlitri di soluzione di polietilenglicole-litio acetato e mescolare mediante pipettaggio.

Incubare il tubo contenente la miscela di trasformazione a 32 gradi Celsius per due ore senza agitare. Aggiungere 43 microlitri di dimetilsolfossido preriscaldato al tubo e mescolare delicatamente. Ora, esporre il tubo a shock termico a 42 gradi Celsius per cinque minuti.

Pellet le cellule e scartare il surnatante come dimostrato in precedenza, quindi pipettare la soluzione residua di polietilenglicole litio acetato TE. Risospendere le cellule in 100 microlitri di acqua sterile e placcarle su una piastra EMM2 contenente gli integratori necessari e 0,2 microgrammi per millilitro di 4-NQO. Quindi, consentire alle colonie di apparire sulle piastre incubando le placche a 32 gradi Celsius per cinque o sei giorni.

Per un ulteriore screening, strisciare le colonie ottenute sulla stessa piastra media in presenza di 0,2 microgrammi per millilitro di 4-NQO. Per un esperimento di trasformazione della libreria, utilizzare 500 microlitri di cellule competenti per la trasformazione e la piastra 1 per 10 della miscela di trasformazione sulla piastra EMM2 con supplementi necessari privi di 4-NQO per calcolare il numero totale di cloni della libreria ottenuti dopo la trasformazione e lo screening per i cloni soppressori. Aggiungere da 100 a 200 microlitri di acqua sterile a ciascun pozzetto di una piastra di microtitolazione sterile a 96 pozzetti.

Utilizzando uno stuzzicadenti sterile o una punta di micropipetta da 20 a 200 microlitri, prelevare una piccola quantità di inoculo da ciascuna colonia ottenuta dopo la trasformazione della libreria di cDNA sulla piastra contenente 4-NQO. Aggiungere l'inoculo di ciascuna delle diverse colonie in ciascun pozzetto della piastra contenente acqua sterile e mescolare accuratamente. Individuare tre microlitri di sospensione cellulare da ciascun pozzetto sulle piastre di agar EMM2 e aggiungere concentrazioni appropriate di 4-NQO alle piastre.

Dopo aver fatto crescere le cellule a 32 gradi Celsius per tre o quattro giorni, identificare le colonie che mostrano crescita in diverse concentrazioni di 4-NQO come soppressori putativi. Per convalidare ulteriormente i soppressori, far crescere i soppressori selezionati e i ceppi di controllo appropriati in mezzo EMM2 contenente 225 microgrammi per millilitro di adenina e uracile a 32 gradi Celsius durante la notte con agitazione. Dopo la fine dell'incubazione, diluire le cellule a una densità ottica di 0,3 in mezzo EMM2 fresco e farle crescere agitando a 32 gradi Celsius fino alla fase intermedia.

Individuare appropriate diluizioni seriali di colture su piastre EMM2 con supplementi necessari contenenti 0,4 micromolari 4-NQO o 0,01% MMS. Per il controllo, individuare i ceppi su una piastra EMM2 con integratori necessari ma privi di qualsiasi agente dannoso per il DNA. Incubare le piastre a 32 gradi Celsius per tre-cinque giorni per monitorare la crescita.

Individua i ceppi mutanti trasformati con il gene di interesse a lunghezza intera o il vettore vuoto come controlli positivi e negativi, rispettivamente, insieme ai trasformanti della libreria. Inoculare una singola colonia di lievito in mezzo EMM2 contenente 225 microgrammi per millilitro di adenina e uracile e far crescere le cellule a 32 gradi Celsius durante la notte agitando a 200-250 RPM. Alla fine dell'incubazione, raccogliere una coltura da 10 millilitri di densità ottica 0,5 centrifugando a 4.000 volte G per due minuti a temperatura ambiente.

Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 0,2 millilitri di tampone di lisi. Aggiungere 0,2 millilitri di alcol isoamilico cloroformio fenolico e 0,3 grammi di perle di vetro lavate con acido al tubo della microcentrifuga. Mescolare facendo vorticare il tubo per due minuti, quindi incubare su ghiaccio per un minuto.

Centrifugare il tubo a 10.000 volte G per 15 minuti a temperatura ambiente. Trasferire lo strato acquoso superiore in un tubo di microcentrifuga fresco e aggiungere 200 microlitri di alcool isoamilico cloroformio fenolo. Dopo aver centrifugato nuovamente a 10.000 volte G per 10 minuti, trasferire lo strato acquoso superiore in un tubo fresco.

Quindi, aggiungere due volumi di etanolo al 100% e 1 per 10 ° volume di acetato di sodio al tubo e incubare a meno 70 gradi Celsius per un'ora. Precipitare il DNA mediante centrifugazione a 10.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante. Lavare il pellet di DNA con etanolo al 70% e asciugare all'aria a temperatura ambiente.

Risospendere il DNA in 20 microlitri di acqua sterile e utilizzare da tre a cinque microlitri di DNA plasmidico per trasformare le cellule competenti di Escherichia coli. Utilizzando il protocollo standard, trasformare i plasmidi di lievito isolati in ceppo TOP10 di Escherichia coli e diffondere le cellule su piastre LB con gli antibiotici necessari. Dopo aver isolato il plasmide dai trasformanti di Escherichia coli utilizzando il protocollo standard di lisi alcalina, seguire le combinazioni appropriate di enzimi di restrizione per verificare il rilascio del frammento di DNA inserito mediante digestione di restrizione.

Successivamente, ritrasformare i plasmidi che mostrano il rilascio dell'inserto dopo la digestione di restrizione nel ceppo di delezione ell1 per verificare la loro capacità di salvare il fenotipo genotossico sensibile allo stress del ceppo di delezione ell1. Il ceppo schizosaccharomyces pombe ell1-cancellato ha mostrato sensibilità verso il 4-NQO rispetto al ceppo wild-type. Un gran numero di colonie si ottengono sulla piastra priva di 4-NQO.

Tuttavia, sono stati ottenuti meno trasformanti sulla piastra 4-NQO in quanto agiscono come soppressori punitivi della sensibilità 4-NQO del mutante nullo ell1. Dei 620 trasformanti, 74 hanno mostrato una crescita su 4-NQO 0,4-micromolare. È stato osservato che solo 16 su 74 hanno mostrato una crescita in presenza di 4-NQO 0,8-micromolare.

Il ceppo di delezione ell1 trasformato con un vettore vuoto e tutti i 16 trasformanti hanno mostrato una crescita sulla piastra priva di 4-NQO. Il mutante di delezione ell1 contenente solo il vettore vuoto non ha mostrato crescita a 0,8-micromolare 4-NQO e sei trasformanti hanno mostrato crescita a 0,8-micromolare 4-NQO, suggerendo che i cloni della libreria presenti in essi potrebbero sopprimere il fenotipo genotossico dello stress del mutante nullo ell1. La digestione di restrizione del plasmide soppressore 84 e 104 ha rilasciato un inserto di una kilobase e 800 coppie di basi, rispettivamente.

La reintroduzione dei cloni plasmidi soppressori nel mutante nullo ell1 ha determinato la soppressione della sensibilità alla crescita associata al 4-NQO. Tuttavia, in presenza di MMS, i plasmidi soppressori contenenti il mutante di delezione ell1 hanno mostrato una crescita maggiore rispetto a quelli con vettore vuoto. Questi screening genetici possono delineare potenziali meccanismi di resistenza e identificare bersagli proteici di nuovi composti antibatterici, antifungini, antiparassitari o antitumorali.

Possono anche identificare il meccanismo d'azione dei farmaci.