Sovraespressione di accoppiamento-based Library Screening in lievito

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie neurodegenerative, come ad esempio quali fattori genetici e percorsi regolano la tossicità delle proteine associate alla malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il processo altamente efficiente di accoppiamento del lievito viene utilizzato per lo screening di modelli di lievito rispetto a un'ampia collezione di geni di libreria. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla tossicità delle proteine delle malattie neurodegenerative, può anche essere applicato allo studio di altri processi cellulari nel lievito, come la tolleranza ad altre condizioni di stress.

Inizia questa procedura aliquotando cinque microlitri per pozzetto di DNA plasmidico da una libreria di plasmidi in array a piastre rotonde a fondo rotondo a 96 pozzetti. Mantieni i piatti a quattro gradi Celsius. Successivamente, inoculare 150 millilitri di peptone destrosio di lievito o terreno YPD in un pallone da 500 millilitri con una colonia del ceppo di lievito aploide W303 Alpha.

Incubare la coltura a 30 gradi Celsius agitando a 200 giri/min durante la notte. La mattina seguente, dopo aver misurato l'OD600 della coltura notturna, diluire la coltura a un OD600 di 0,1 in due litri di YPD. Incubare a 30 gradi Celsius agitando a 200 giri/min per circa cinque ore, fino a quando la coltura raggiunge un OD600 compreso tra 0,4 e 0,6.

Per raccogliere la coltura di lievito, riempire otto flaconi da centrifuga sterili da 250 millilitri e centrifugare a 3000 xG per 10 minuti a temperatura ambiente. Versare il surnatante senza rompere il pellet. Lavare il lievito come descritto nel protocollo di testo e consolidare le cellule in due provette da centrifuga.

Risospendere ogni pellet di cella in 25 millilitri di una soluzione di acetato di litio 0,1 molare. Combina le cellule risospese, aggiungi cinque millilitri di DNA spermatico di salmone e trasferiscili in un pallone da 150 millilitri. Incubare a 30 gradi Celsius agitando a 225 giri/min per 30 minuti.

Dopo 30 minuti, versare la miscela di cellule in un serbatoio sterile di reagenti monouso. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 35 microlitri della miscela cellulare in ciascun pozzetto delle piastre a 96 pozzetti a fondo rotondo, contenenti il DNA plasmidico della libreria preparato in precedenza. Agitare le piastre a 96 pozzetti a 1000 giri/min per un minuto.

Incubare le piastre a 30 gradi Celsius senza agitare per 30 minuti. Non impilare i piatti, in modo che il calore possa trasferirsi in modo più efficiente. Rimuovere le piastre a 96 pozzetti dall'incubatore a 30 gradi Celsius e mescolarle a 1000 giri/min per 30 secondi.

Aggiungere 125 microlitri di tampone di trasformazione a ciascun pozzetto, quindi agitare le piastre a 1000 giri/min per un minuto. Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi scaldare il lievito posizionando le piastre in un'incubatrice a 42 gradi Celsius per 15 minuti.

Centrifugare le piastre a 3000 xG per cinque minuti. Rimuovere il buffer di trasformazione dai pozzetti capovolgendo le piastre su un cestino dei rifiuti e scaricando con forza il buffer dalle piastre. Tamponare rapidamente le piastre capovolte su un tovagliolo di carta pulito per rimuovere il liquido sopra le piastre.

Sciacquare le cellule aggiungendo ad ogni pozzetto, 200 microlitri di terreno di dropout minimo corrispondenti al marcatore selezionabile sul plasmide della libreria. Qui viene utilizzato il mezzo sintetico ura minus. Centrifugare le piastre a 3000 xG per cinque minuti.

Rimuovere il surnatante su un cestino dei rifiuti come dimostrato in precedenza. Aggiungere 160 microlitri di minimo ura minus medium, contenente il 2% di glucosio a ciascun pozzetto e agitare le piastre a 1000 giri/min per un minuto. Incubare le piastre senza agitare a 30 gradi Celsius per 48 ore.

Dopo 48 ore, una pallina di lievito trasformato dovrebbe essere visibile sul fondo di ogni pozzetto. Utilizzando un dosatore di liquidi, aggiungere 100 microlitri di ura minus medium contenente glucosio in ciascun pozzetto di un nuovo set di piastre da 96 pozzetti. Agitare le piastre contenenti il lievito trasformato a 1000 giri/min per 30 secondi.

Utilizzando un replicatore sterile di plastica a 96 pin, posizionare i perni nei pozzetti contenenti il lievito trasformato e quindi inoculareli nei pozzetti corrispondenti delle nuove piastre riempite di terreno. Incubare le nuove piastre a 30 gradi Celsius per 24 ore. Dopo 24 ore, una pallina di lievito dovrebbe essere visibile sul fondo di ogni pozzetto che contiene lievito trasformato con successo.

Per conservare questi ceppi di lievito come scorte di glicerolo, aggiungere 50 microlitri di glicerolo al 50% in ciascun pozzetto, agitare le piastre a 1000 giri/min per 30 secondi, sigillare le piastre con un foglio di alluminio e congelare a meno 80 gradi Celsius. Per far rivivere i ceppi della libreria dallo stock di glicerolo, togliete le piastre da 96 pozzetti dal congelatore a meno 80 gradi Celsius, rimuovete il foglio di alluminio e lasciate scongelare il lievito a temperatura ambiente per circa 30 minuti. Una volta che il lievito si è scongelato, utilizzare un replicatore sterile di plastica a 96 pin per inoculare le scorte di glicerolo in 160 microlitri di terreno fresco di ura minus contenente il 2% di glucosio in piastre a 96 pozzetti e incubare a 30 gradi Celsius per 24 ore.

Subito dopo aver utilizzato i ceppi della libreria, sigillare le piastre e rimetterle nel congelatore a meno 80 gradi Celsius. Lo stesso giorno in cui i ceppi della libreria vengono scongelati, inoculare il ceppo di lievito query in 50 millilitri di YPD e crescere a 30 gradi Celsius con agitazione a 250 giri/min durante la notte. La mattina seguente, versare il ceppo di lievito query in un serbatoio sterile di reagenti monouso e aliquotare 160 microlitri del ceppo query in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.

Utilizzando l'erogatore di liquidi, erogare 160 microlitri per pozzetto di terreno YPD in piastre da 96 pozzetti. Agitare brevemente le piastre a 96 pozzetti contenenti il ceppo di query e le piastre di deformazione della libreria, quindi utilizzare un replicatore sterile a 96 pin per trasferire i ceppi della libreria alle piastre YPD che sono state inoculate con il ceppo di query. Incubare le piastre YPD a 30 gradi Celsius per 24 ore.

Dopo 24 ore una pallina di lievito sarà visibile sul fondo di ogni pozzetto. Riempire piastre a 96 pozzetti con un terreno di droupout minimo contenente il 2% di raffinosio corrispondente ai marcatori selezionabili sul plasmide nel ceppo query, nonché sul plasmide di libreria. Utilizzare un replicatore sterile a 96 pin per trasferire il lievito dalle colture di accoppiamento YPD al terreno selettivo.

Incubare le piastre da 96 pozzetti a 30 gradi Celsius per 48 ore. Solo le cellule di lievito che si sono accoppiate e hanno formato cellule diploidi e quindi contengono sia il plasmide query che il plasmide di libreria saranno in grado di crescere in questo mezzo. Dopo 48 ore di crescita nel terreno selettivo contenente Raffinosio, osservare che un pellet è visibile sul fondo dei pozzetti che contengono cellule diploidi.

Agitare le piastre a 96 pozzetti a 1000 giri/min per un minuto. Utilizzare una smacchiatrice robotizzata per individuare il lievito su piastre di agar in quadruplicato in piastre ura-his-droupout contenenti il 2% di galattosio e il 2% di agar e in piastre ura-his-droupout contenenti il 2% di glucosio e il 2% di agar. Dopo la smacchiatura, lasciare asciugare le piastre di agar e poi posizionarle a testa in giù in un'incubatrice a 30 gradi Celsius per quattro giorni.

Ogni 24 ore, fotografare le piastre di agar per registrare la crescita del lievito. La tossicità della proteina FUS associata alla SLA è stata esaminata per la prima volta nel lievito diploide. Come indicato dalla piastra di agar contenente galattosio, che induce la FUS, la tossicità della FUS è costante sia nel lievito diplod che in quello aploide.

Cinque geni precedentemente identificati come soppressori della tossicità FUS da un metodo basato sulla trasformazione sono stati testati con il metodo dell'accoppiamento. La corsia uno è un ceppo di lievito di controllo trasformato con due vettori vuoti. La corsia due è il ceppo di lievito FUS diploide con un vettore vuoto in cui l'espressione di FUS è molto tossica.

Le corsie da tre a sette mostrano lievito diploide che esprime FUS e un gene di soppressione. Tutti e cinque i geni salvano la tossicità di FUS nel lievito diploide, indicando che il metodo di accoppiamento era efficace. Questo metodo basato sull'accoppiamento è stato poi applicato a uno screening di una libreria di sovraespressione di 940 geni.

E viene mostrata una foto di una targa rappresentativa. Come indicato sulla piastra di galattosio, dove sono espressi FUS e i geni della libreria, FUS era tossico per la cellula di lievito diplod. Il gene della libreria, indicato dal quadrato verde, ha salvato la tossicità da FUS.

Mentre il gene della libreria, indicato dal quadrato rosso, ha aumentato la tossicità. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 120 ore, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di verificare in anticipo che il fenotipo utilizzato per lo screening non sia aploide dipendente dal tipo di accoppiamento.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare i fattori genetici in caso di sovraespressione che salvano la tossicità delle proteine associate alla malattia nel lievito. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica può aprire la strada ai ricercatori nel campo delle malattie neurodegenerative, per esplorare i meccanismi di citotossicità delle proteine associate alla malattia nel modello di lievito. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il test della beta galattosidasi, per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se il salvataggio è specifico.