Metodo ottimizzato per la coltivazione e la biopotenziazione microbica di Typha latifolia (tifa)

Il nostro lavoro affronta la mancanza di protocolli per la coltivazione della sagitta da seme. Abbiamo sviluppato metodi riproducibili per la germinazione dei semi, la crescita precoce e l'aumento microbico biologico per supportare future ricerche microbiche vegetali. Pochi studi coltivano la tifa da seme o la tracciano fino alla maturità, eppure le tifa sono comunemente utilizzate nella ricerca sulla bonifica delle zone umide.

La maggior parte delle ricerche sulle sagole prevede l'acquisto di rizomi per la propagazione delle sagote in studi di laboratorio. Pochi studi coltivano la stalla da seme, senza metodi standardizzati. Raggiungere una germinazione costante e una colonizzazione persistente dei microbi introdotti è stata una sfida importante.

Abbiamo sviluppato metodi riproducibili per la germinazione dei semi e l'aumento biologico microbico, dimostrando come l'inoculazione precoce aiuti a sostenere la colonizzazione a lungo termine. Per cominciare, si usano forbici da giardino per tagliare il fusto di una pianta di Typha latifolia a circa due centimetri dalla base dell'infiorescenza. Rimuovi i semi dall'infiorescenza, trasferiscili in un frullatore di laboratorio finché il frullatore non è circa 1/4 pieno, corrispondendo a circa 250 millilitri di semi non compattati.

Ora riempi il frullatore con 500 millilitri di acqua del rubinetto, assicurandoti di mantenere uno spazio di 10 centimetri. Frulla la miscela a velocità medio-bassa per 20 secondi e trasferisci immediatamente il contenuto viscoso in un becher da un litro. Trasferire circa 100 millilitri della miscela di acqua per semi nel frullatore.

Poi aggiungi da 400 a 600 millilitri di acqua fresca del rubinetto e frullare a velocità medio-alta per 20 secondi. Versa il contenuto in un becher fresco da un litro. Ora riempi il becher con acqua del rubinetto fino a 800 millilitri.

Dopo averlo lasciato riposare per 60 secondi, raccogli via il fango galleggiante dalla parte superiore senza disturbare i semi depositati sul fondo. Versa lentamente l'acqua residua e trasferisci i semi in un becher da 100 millilitri. Ripeti il processo di miscelazione per il residuo di fango d'acqua dei semi. Successivamente, posiziona il becher contenente i semi separati su un piatto per mescolare.

Dopo aver mescolato, raccogli via qualsiasi materiale vegetale galleggiante dalla superficie del becher. Versa i semi in un imbuto Buchner con carta filtrante attaccata a un aspirapolvere e lasciali asciugare tutta la notte. Conservare i semi essiccati a 20 gradi Celsius in tubi conici di polipropilene da 50 millilitri.

Prepara piastre a media Murashige e Skoog a metà forza con agar fitofitofo all'1%. Trasferire circa un milligrammo dei semi essiccati in un tubo conico di polipropilene da 15 millilitri. Poi aggiungi 10 millilitri di acqua sterile doppia distillata al tubo.

Posiziona il tubo su uno shaker orbitale a velocità medio-alta per 10 minuti. Ora togli l'acqua dal tubo e aggiungi cinque millilitri di soluzione di polisorbato 20 allo 0,1% preparata in acqua sterile doppia distillata. Scuoti il tubo a velocità medio-alta per 10 minuti.

Rimuovi la soluzione di polissorbato 20. Esegui tutti i passaggi successivi davanti a una cappa a fiamma o a flusso laminare. Sostituire la soluzione con cinque millilitri di candeggina commerciale al 30% e soluzione di polisorbato 20 allo 0,025% preparati in acqua sterile doppia distillata.

Sostituisci il soprandanzante con acqua sterile doppia distillata. Poi scuoti il tubo a velocità medio-alta per cinque minuti. Dopo il terzo risciacquo, ruota il tubo a bassa velocità per 24 ore per indurre la germinazione.

Il giorno successivo, rimuovere l'acqua in eccesso e assicurarsi che rimangano tre millilitri di liquido nel tubo. Ora asepticamente, taglia la punta di una punta di pipetta in plastica da 1000 microlitri. Usa la punta tagliata della pipetta per pipettare vigorosamente e sospendere i semi all'interno della punta.

Impiatta i semi e il liquido su piastre di agar Murashige e Skoog a metà concentrazione. Fai ruotare delicatamente il piatto per distribuire uniformemente i semi. Avvolgi le piastre con pellicola sigillante da laboratorio, poi mettile in una camera di crescita con un ciclo di luce di 16 ore e un ciclo di buio di 8 ore a 23 gradi Celsius e umidità del 70%.

Per inoculare i semi di candegna di gatta, sterilizza i semi con candeggina polisorbato 20 e acqua doppiamente distillata come dimostrato. Misurare la densità ottica di una coltura notturna di isolato di Luteimonas a 600 nanometri. Normalizza la coltura a un valore di assorbenza di 1,0 diluendola nel mezzo di coltura.

Ora centrifuga un millilitro di coltura a 9.300 G per due minuti. Rimuovi il sovrantato e risospendi il pellet in un millilitro di PBS. Dopo la centrifugazione e la rimozione nuovamente del surnadante, risospendere il pellet batterico in un millilitro di acqua sterile doppiamente distillata.

Usa semi sterilizzati, poi dilui l'inoculo con una diluizione da uno a dieci con tensioattivo organosiliconico allo 0,025% nello stesso tube. Scuoti la sospensione a bassa velocità per 24 ore prima della germinazione dei semi. Inizia riempiendo un'unità di camera di crescita vegetale sterile con un terreno preferito pre-bagnato con acqua del rubinetto.

Copri la punta Luer lock con carta stagnola e autoclave l'unità su un ciclo liquido per 20 minuti. Successivamente, in condizioni sterili, si collega un'unità di filtro da 0,2 micrometri al connettore Luer lock sulla camera di crescita. Apri la camera e aggiungi 500 microlitri di fertilizzante sterilizzato con filtro 1%20 per 20 per 20 al terreno.

Mescola il terreno con una spatola sterile aggiungendo contemporaneamente acqua sterile doppia distillata per mantenere l'idratazione senza saturare troppo il terreno. Ora, usa una lametta sterile per tagliare Murashige e agar Skoog da piastre contenenti una debole vecchia piantina in quarti. Con una spatola sterile, trasferisci una sezione di agar con la piantina sul terreno preparato nella camera di crescita.

Trasferire l'unità della camera di crescita in un incubatore di crescita delle piante impostato su un ciclo di luce di 16 ore e un ciclo di 8 ore di buio a 23 gradi Celsius e umidità del 70%. La scarificazione completa dei semi di Typha ha causato componenti visibilmente separati, mentre la scarificazione incompleta ha lasciato il becco attaccato e i semi non scarizzati sono rimasti intatti. Il sistema idroponico sterile ha dimostrato di supportare la crescita di specie di tagoa e juncus, qui indicate come Juncus, che venivano mantenute all'interno del sistema sterile fino a un anno.

Il tasso di germinazione più alto del seme, pari al 20,8%, è stato osservato utilizzando il metodo al 30% di candeggina e polisorbato 20, significativamente superiore rispetto a tutti gli altri trattamenti di sterilizzazione tranne che per il metodo del gas cloro di 1 ora, che non è riuscito a garantire la sterilizzazione completa dei semi. A sette giorni dalla scarificazione, le piantine di Typha in germinazione hanno sviluppato radicali visibili e tessuto germinale nell'ambiente non sterile della placca di Petri. Dopo il trapianto nel suolo, una parte delle piantine di Typha si è stabilita con successo e ha prodotto nuovo tessuto germinale entro una o due settimane.

Dopo l'inoculazione con specie di Luteimonas portanti un plasmide DsRed, è stata osservata una colonizzazione batterica fluorescente rossa in tutte le radici della piantina di Typha a 16 giorni dall'inoculazione.