Profilazione degli O-glicani di mucina permetilata mediante spettrometria di massa a tempo di volo con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice

Stiamo studiando la glicobiologia delle interazioni tra microrganismi ospitanti nel tratto gastrointestinale, con particolare attenzione al ruolo dello strato muco che ricopre il tratto gastrointestinale, e in particolare sulle mucine e sui loro glicani nella salute e nelle malattie. I mucini glicani sono sempre più riconosciuti come fattori importanti nelle interazioni ospite-microbo, poiché forniscono nutrienti e siti di legame per i batteri. Un'alterazione del profilo di glicosilazione può portare a alterazioni della composizione microbiotica e viceversa, fenotipi comunemente osservati negli stati patologici.

Tuttavia, le mucine sono notoriamente difficili da studiare perché sono fortemente glicosilate. Le innovazioni nelle tecniche di campionamento e nell'analisi bioinformatica di follow-up possono far progredire il settore, così come nuovi approcci di elaborazione dei campioni per aumentare la produttività e ridurre i tempi dalla raccolta del campione ai risultati. Altre tecniche analitiche permettono una caratterizzazione strutturale più dettagliata dei glicani, ma richiedono lunghi tempi di analisi e di durata.

La tecnica qui descritta utilizzando la spettrometria di massa MALDI-TOF ha il vantaggio della velocità, che la rende ad alta produttività e adatta per lo screening e la profilazione. Per cominciare, mescola mucine purificate con 250 microlitri del tampone di eliminazione beta in una fiala di vetro da quattro millilitri. Sigilla saldamente la fiala con un tappo rivestito di politetrafluoroetilene e incuba la reazione a 45 gradi Celsius per 16 ore.

Sul ghiaccio, aggiungi un millilitro di soluzione di acido acetico al 5% alla miscela di reazione in modo a gocce. Per desalinizzare il campione, inserisci una pipetta di vetro con una piccola quantità di lana di vetro. Aggiungi 1,5 millilitri di sospensione in resina alla pipetta di vetro dalla parte superiore, poi lascia che si depositi e dreni.

Ora, lava la resina con due millilitri di acido acetico al 5% e elimina il flusso diretto. Successivamente, aggiungere il campione di mucina alla colonna di desalinizzazione e raccogliere il flusso in un tubo da cinque millilitri. Lava la colonna due volte con un millilitro di acido acetico al 5% per raccogliere il flowthrough.

Poi, utilizzando un evaporatore centrifugo, rimuovere l'acido acetico e concentrare il campione a cinque millibar e 30 gradi Celsius per due ore. Sciogliere il campione in 0,5 millilitri di acido acetico metanolico e asciugarlo sotto un getto di azoto. Utilizzando una siringa di vetro, aggiungere quattro millilitri di DMSO alla fiala contenente miscela di idrossido di sodio e metanolo.

Dopo il vortice, centrifugare la soluzione a 2.000 G per due minuti. Escanta con cura il sovrantantante e rimuovi i sali senza disturbare il gel. Dopo aver verificato che non si formino più sali, si risospede il gel in quattro millilitri di DMSO anidro per preparare la sospensione della base permetilazionale.

Successivamente, al campione di mucina essiccata, aggiungi DMSO anidro e base di permetilazione subito seguiti da iodometano. Incubare la reazione di permetilazione per 30 minuti a temperatura ambiente con una vigorosa agitazione. Poi, aggiungi 0,5 millilitri d'acqua per interrompere la reazione.

Dopo che il campione diventa torbido, risciacqualo con azoto finché non diventa limpido. Carica il campione su una piastra di estrazione a bilancia lipofilica idrofila da 96 pozzi. Applicare pressione positiva per spingere i campioni attraverso la fase solida a una portata di circa un millilitro al minuto.

Dopo aver scartato il flowthrough, lava i pozzi due volte con un millilitro d'acqua. Eludi i glicani dalla piastra due volte con un millilitro di metanolo. Applicare pressione solo finché il metanolo non inizia a uscire dalla placca, poi lascia che il flusso gravitazionale mantenga la velocità richiesta.

Asciugare il campione con un evaporatore centrifugo e scioglierlo in 10 microlitri di TA50. Dopo aver miscelato un microlitro di campione e la matrice, caricalo su una piastra bersaglio in acciaio MALDI e lascialo asciugare. Per l'analisi dei dati, caricare il file ASCII esportato dello spettro di massa in GlycoWorkbench.

Dopo aver eseguito la correzione di base, calcolare i centroidi di picco e, nella finestra pop-up, selezionare l'intervallo di massa appropriato, il rapporto segnale-rumore minimo e l'intensità di picco minima della spettrometria di massa. Poi, usa lo strumento Glyco-Peakfinder per identificare le composizioni strutturali che corrispondono alla lista dei picchi. Scegli perMe come derivazione, redEnd come estremità riducente, e imposta il numero minimo e massimo di residui attesi.

Per le mucine, seleziona Hexose, N-Acetil-Esosamina, Deossi-Esosso e N-Acetilneuraminico acido. Per i glicani solfati, usa l'opzione Altro residuo con massa di 87,9. Per i dati MALDI-TOF, imposta il numero massimo di ioni e cariche di sodio a uno ciascuno, e imposta la precisione a 0,5 Dalton.

Seleziona tutte le annotazioni corrette con il tasto Control e clicca su ciascuna. Clicca con il tasto destro sulle annotazioni selezionate e scegli Aggiungi alla lista dei picchi annotati. Per generare un report confrontando più spettri annotati, vai su Strumenti seguiti da Reportistica e crea un report confrontando profili diversi.

Stampa il rapporto in PDF per salvarlo. Per l'analisi degli spettri di frammentazione, carichi gli spettri su GlycoWorkbench e generi la lista dei picchi come dimostrato in precedenza. Disegna strutture di glicani presunti che corrispondono alle composizioni annotate dei glicani.

Per generare frammenti per ogni struttura, clicca con il tasto destro per selezionare Copia frammenti nella tela e scegli Calcola frammenti nello strumento Frammenti. Per ulteriori analisi di frammentazione, clicca su un picco di interesse nel visualizzatore di spettro. Clicca con il tasto destro e seleziona Trova tutte le strutture corrispondenti ai picchi per interrogare il rapporto di carica principale del picco selezionato rispetto ai database online.

Seleziona strutture presunte di interesse e clicca con il tasto destro per copiarle nella finestra della tela con l'opzione appropriata. Per calcolare i possibili frammenti di ciascuna struttura glicanica, si seleziona la struttura nella tela. Poi, sotto strumenti e frammenti, seleziona calcolare frammenti per la struttura corrente.

Se sono stati calcolati frammenti per più di una struttura glicalica, vai alla vista tabella Frammenti sotto la scheda Riassunto per visualizzare la tabella di confronto. Seleziona i frammenti che corrispondono alla lista dei picchi per ciascuna potenziale struttura glicana. Clicca con il tasto destro e scegli Copia frammenti sulla tela dal menu a tendina.

Infine, nella scheda Strumenti, vai su Profiler seguito da Annota i picchi con tutte le strutture. Poi seleziona Strumenti, Reportistica e crea un report delle annotazioni. La desalinizzazione tramite scambio ionico ha portato a un recupero migliore dei glicani più grandi, con queste strutture più grandi che rappresentano il 31% del totale dei glicani rispetto al 21% per l'estrazione PGC.

Tra le strutture glicane identificate, una glicana è stata individuata solo attraverso il campione desalinizzato nello scambio ionico. Inoltre, la desalinizzazione tramite scambio ionico e rimozione del borato ha portato a spettri con rapporti segnale-rumore maggiori rispetto a quelli prodotti dopo la desalinizzazione tramite estrazione in fase solida con PGC. I tempi di reazione di permetilazione di 30 e 90 minuti hanno portato all'identificazione di 33 picchi di glicani, mentre una reazione di cinque minuti ne ha identificati solo 31.