Un manuale Schermo piccole molecole si avvicina ad alta velocità Uso embrioni di zebrafish

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di eseguire uno screening chimico in embrioni di pesce zebra utilizzando l'elaborazione manuale del campione. Ciò si ottiene posizionando prima il pesce zebra adulto nelle camere di accoppiamento con un divisore durante la notte, e poi rimuovendo il divisore la mattina successiva per raccogliere gli embrioni. Successivamente, i gruppi di embrioni di zebrafish vengono disposti in piastre a 96 pozzetti e quindi trattati con un farmaco allo stadio di sviluppo desiderato.

Quindi gli embrioni vengono lasciati sviluppare, fissati con paraldeide al 4% e analizzati per valutare gli effetti di piccole molecole sul processo di sviluppo di interesse. I risultati mostrano cambiamenti nello sviluppo come l'aumento o la perdita di domini di espressione genica che possono indicare alterazioni nel solfato o nella morfogenesi dei tessuti causate dalle piccole molecole che sono state interrogate. Le implicazioni di questa tecnica si estendono al trattamento clinico per una varietà di malattie grazie alla capacità di identificare composti potenzialmente terapeutici.

In generale, le persone che non conoscono questa tecnica possono avere difficoltà perché hanno bisogno di acquisire la destrezza necessaria per lavorare con gli embrioni, come trasferirli tra piastre multipozzetto senza danni. A dimostrare la procedura saremo io ed Eric Donahue, un ricercatore universitario in laboratorio per impostare gli accoppiamenti dei pesci zebra. Utilizzare camere di accoppiamento con divisori: posizionare il pesce zebra maschio adulto su un lato del divisore e il pesce zebra femmina adulto sull'altro lato.

Per ogni piastra da 96 pozzetti di piccole molecole da testare. Prepara 25 vasche di accoppiamento e lasciale durante la notte. Il giorno successivo, rimuovere la camera che separa ogni coppia di pesci e dopo un'ora, utilizzare un colino a maglie fini per raccogliere gli embrioni prima di metterli in piastre di Petri contenenti terreno E tre con una pipetta di trasferimento.

Rimuovere i detriti dalle piastre e sotto uno stereoscopio. Osserva ogni covata di embrioni e rimuovi eventuali uova non fecondate. Decantare l'E tre medio e sostituirlo con un nuovo E tre.

Quindi posizionare ogni piatto di embrioni in un'incubatrice a 28,5 gradi Celsius per due ore. Controlla di nuovo le piastre e scarta eventuali uova non fecondate aggiuntive. Continuare a incubare gli embrioni fino allo stadio del 40%.

Rimuovere la piastra della libreria chimica da meno 80 gradi Celsius. Utilizzare un foglio di alluminio per coprirlo e lasciarlo scongelare a temperatura ambiente con una pipetta a otto canali. Aggiungere 99 microlitri di E tre alle colonne da due a 12 di una piastra a 96 pozzetti.

Quindi aggiungere un microlitro dei composti appropriati ai pozzetti nelle colonne da due a 11 qui, designati come campioni sperimentali Pipettare un microlitro di DMSO nella colonna di controllo qui progettata per essere la colonna 12. Utilizzare un foglio di alluminio per coprire la piastra di diluizione e rimettere la libreria chimica di serie nel congelatore. Successivamente, dopo aver selezionato una capsula di Petri contenente embrioni allo stadio epi al 40%, utilizzare una pipetta di trasferimento per posizionare con cura circa 10 embrioni per pozzetto nelle colonne da due a 12 di un 96.

Pozzetto piastra. Utilizzare una pipetta di trasferimento in vetro per rimuovere l'eccesso di E tre da ciascun pozzetto ed espellere in un contenitore per rifiuti liquidi. Per trattare chimicamente gli embrioni, trasferire 100 microlitri di ciascuna diluizione chimica dalla piastra a 96 pozzetti nel rispettivo pozzetto degli embrioni per creare una camera umida con un tovagliolo di carta e metterla in un contenitore sensibile alla luce.

Abbastanza grande da contenere una piastra da 96 pozzetti. Quindi utilizzare un tappetino da soffitto per sigillare la piastra. Mettilo nel contenitore sensibile alla luce e incubalo a 28,5 gradi Celsius per il periodo di tempo desiderato.

Per rimuovere le sostanze chimiche, aggiungere 300 microlitri di E tre a ciascuna fila di pozzetti trattati con farmaci. Quindi prelevare il terreno prima di utilizzare E tre per lavare gli embrioni tre volte per fissare gli embrioni, trasferirli in quattro piastre da 24 pozzetti etichettate posizionando la pipetta davanti a uno sfondo scuro. Dopo ogni trasferimento del pozzetto per identificare gli embrioni rimasti nella pipetta e per evitare il crossover, rimuovere gli embrioni morti.

Prelevare il tre E in modo che gli embrioni siano appena immersi nel liquido. Quindi utilizzare una pipetta di vetro per aggiungere due gocce di 50 milligrammi per millilitro di pronasi a ciascuna. Incubare bene gli embrioni per cinque minuti prima di agitare i pozzetti per causare la rottura del Corian.

Dopo aver usato E tre per lavare gli embrioni due volte, prelevare e scartare il rimanente E tre. Aggiungere il 4% di P-F-A-P-B-S a ciascun pozzetto e incubare gli embrioni durante la notte a quattro gradi Celsius. Quindi eseguire uno screening di interesse come l'ibridazione in situ con montaggio a foro o desiderare, come indicato nel protocollo di testo, di valutare gli embrioni dallo screening chimico.

Trasferirli su piastre da 12 pozzetti etichettate prima di utilizzare uno stereomicroscopio per osservarle come descritto in questo diagramma. È pratico per una singola persona eseguire uno screening chimico genetico su circa 600 composti nel corso di nove settimane di sforzo dedicato, e tale tempo può essere ridotto a tre settimane se eseguito da tre persone. Pertanto, il tempo in panchina di una o poche persone può aggirare la necessità di apparecchiature che richiedono molte risorse come i sistemi automatizzati.

Come mostrato qui, gli embrioni di pesce zebra sono stati sottoposti a singoli composti da una libreria bioattiva dal 50% delle persone a 24 HPF, e quindi analizzati a piacere, utilizzando un cocktail di tre sonde ribo per rilevare segmenti di nefrone. Ad esempio, il sistema di classificazione, un composto che ha portato a un tubulo contorto prossimale notevolmente allargato o PCT, sarà classificato come classe uno, che rappresenta la classe associata al difetto più grave e al più alto livello di confidenza nel fenotipo osservato. Il composto verrebbe quindi annotato come PCT di classe uno.

Inoltre, questa classificazione fornisce un modo semplice e veloce per descrivere una piccola molecola di interesse, compresa la gravità del suo effetto sull'organismo, la regione interessata dal farmaco e il modo in cui la regione è interessata. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mettere in scena gli embrioni nel momento di sviluppo corretto. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire uno screening chimico manuale con embrioni di pesce zebra.