Large Scale Zebrafish-Based In vivo Screen piccole molecole

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di scoprire piccole molecole che modulano in modo specifico aspetti chiave dello sviluppo e della fisiologia embrionale. Ciò si ottiene inserendo un gran numero di uova fecondate in 96 e vagliando le piastre come seconda fase. Aliquote di una libreria di piccole molecole vengono aggiunte alle piastre a 96 pozzetti accanto agli embrioni del 96.

Le piastre a pozzetti vengono esaminate per i fenotipi suscitati dalle piccole molecole. Si ottengono risultati che mostrano quali piccole molecole influenzano in modo specifico lo sviluppo o la fisiologia dei super pesci. Ciao, mi chiamo Charles Hong della Vanderbilt University School of Medicine.

Nel nostro laboratorio, eseguiamo screening chimici ad alta produttività utilizzando embrioni di difish. Questa è una tecnica relativamente semplice che può essere ampiamente adattata per scoprire nuovi composti bioattivi. Il pomeriggio prima del giorno dello screening chimico, allestisci da 10 a 20 vasche di riproduzione del pesce zebra.

Posizionare un divisorio in ogni vasca e riempire ogni vasca con l'acqua del sistema di acquacoltura utilizzando una rete da pesca che trasferisce, un maschio adulto e una o due femmine adulte nel contenitore interno. In ogni vasca di riproduzione, etichettare le vasche e coprirle con un coperchio la mattina dello schermo. Rimuovete i divisori dalle vasche di riproduzione e permettete al pesce zebra di accoppiarsi.

Nel corso dell'ora successiva. Lascia che le uova fecondate cadano attraverso la griglia sul fondo di ogni contenitore interno. Dopo un'ora, rimettete il pesce seber adulto nelle vasche di stoccaggio permanenti.

Rimuovi il contenitore interno e raccogli le uova filtrando l'acqua in ogni vasca di riproduzione attraverso un colino da tè di plastica. Capovolgere il colino su una capsula di Petri e sciacquare delicatamente il colino per far scorrere le uova nella capsula di Petri. Utilizzando un flacone di lavaggio contenente E tre terreni, tutti gli ovuli non fecondati che appaiono opachi devono essere rimossi.

Utilizzando una pipetta di plastica usa e getta, ogni incrocio di accoppiamento dovrebbe produrre circa 200 embrioni. Quindi trasferire circa cinque embrioni in E tre terreni in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta per pasta di vetro. Una volta che gli embrioni sono disposti su una piastra a 96 pozzetti.

Rimuovere la maggior parte possibile del terreno E tre dai pozzetti utilizzando una pipetta a 12 canali. Facendo attenzione a non forare gli embrioni. Utilizzando la pipetta a 12 canali, erogare 250 microlitri di E tre.

Il terreno contenente 0,5 microgrammi per millilitro può micina in ciascun pozzetto il più rapidamente possibile in modo da non permettere agli embrioni di seccarsi. Mettere le piastre a 96 pozzetti in un incubatore a 28,5 gradi Celsius fino a raggiungere lo stadio desiderato in cui devono essere aggiunti i composti. In questo protocollo, cerchiamo composti che perturbano il pattern embrionale precoce e incuberemo gli embrioni per tre ore o fino a quando lo stadio di 1000 cellule non sarà raggiunto da oltre il 90% degli embrioni che vengono tipicamente forniti nelle librerie di piccole molecole.

In una piastra sorgente da 96 pozzetti con ogni composto conservato in DMSO come un ceppo da 10 millimolari, circa 60 minuti prima che gli embrioni raggiungano lo stadio desiderato, scongelare un numero appropriato di piastre da 96 pozzetti contenenti aliquote di piccole molecole. Prendere nota del numero di serie o di altro numero di identificazione delle piastre di origine per ridurre al minimo la condensa sulle piastre. T cadere in una camera di essiccazione contenente essiccatore. A destra.

Far girare brevemente le piastre in una centrifuga da tavolo dotata di un adattatore per piastre a più pozzetti. Rimuovere il nastro di alluminio dal soffitto dalla piastra sorgente utilizzando una pipetta a 12 canali, diluire i composti nella piastra sorgente alla concentrazione desiderata con DMSO. In questo protocollo, utilizziamo una concentrazione finale di 0,5 millimolari e aggiungiamo 4,75 microlitri di DMSO per diluire la piastra madre da 10 millimolari.

Quando gli embrioni nella piastra a 96 pozzetti raggiungono lo stadio desiderato, utilizzare una pipetta a 12 canali per trasferire 2,5 microlitri di composti dalle piastre sorgente alle piastre riceventi contenenti gli embrioni. Coprire le piastre che ora contengono gli embrioni e i composti con i coperchi e annotare il numero di identificazione delle piastre sorgente sulle piastre per embrioni. Mescolare le piastre agitando delicatamente e metterle in un'incubatrice a 28,5 gradi Celsius.

Coprire ogni piastra di origine contenente piccole molecole inutilizzate con soffitto di alluminio, nastro adesivo e riporre in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine. Prima di eseguire la schermata visiva, formulare un criterio di hit specifico. Ad esempio, in uno screening per inibitori di piccole molecole dello sviluppo di quattro cervelloni, un colpo può essere un composto che conferisce la perdita del proencefalo.

L'assenza di occhi è un facile indicatore visivo della perdita del proencefalo e non richiede fluorescenza per essere dosata nei momenti desiderati dello sviluppo. Rimuovere le piastre da 96 pozzetti contenenti embrioni trattati con composti dall'incubatrice ed esaminare ciascun pozzetto al microscopio stereoscopico durante lo screening per gli inibitori di piccole molecole dello sviluppo di quattro cervelloni, esaminare le piastre a 28 ore per la perdita dell'occhio come marcatore dell'inibizione dello sviluppo di quattro cervelle. Registrare l'identità della piastra e la posizione dei pozzetti per ogni pozzetto in cui almeno tre embrioni su cinque presentano il fenotipo hi prescritto Riposizionare la piastra da 96 pozzetti nell'incubatrice.

Riconfermare la perdita degli occhi e del proencefalo a 48 ore. Anche se gli embrioni non avranno un proencefalo, sopravviveranno fino ad almeno quattro giorni. Riconferma un potenziale successo testando nuovamente gli effetti del composto a diverse dosi per ogni dose, 10 embrioni vengono testati in 0,5 millilitri di E tre terreni in un formato piastra a 48 pozzetti.

La tempistica dell'edizione composta per la ripetizione del test deve essere identica a quella dello screening originale. Un HIIT è confermato quando il fenotipo suscitato viene riprodotto in modo dose-dipendente dopo la ripetizione del test del composto. Infine, identificare il composto hi dal database di piccole molecole nella libreria chimica.

Utilizzando lo screening chimico visivo basato sul pesce zebra, abbiamo scoperto un inibitore del segnale del riccio a piccola molecola basato sul suo effetto sull'asse del corpo. Questa immagine mostra embrioni esposti all'inibitore del riccio che mostrano una marcata curvatura ventrale della coda. A 24 ore, gli stessi embrioni esaminati a 48 ore mostrano ancora il fenotipo curvo ventralmente.

Questa immagine mostra l'embrione trattato con il composto rispetto all'embrione mutante della via del riccio. Una volta padroneggiata questa tecnica, una persona può esaminare circa 400 composti a settimana in un paio d'ore. Questa tecnica ha anche aperto la strada ai biologi chimici per studiare cose come lo sviluppo cellulare, le vie di segnalazione cellulare e lo sviluppo embrionale.

Quando si lavora con piccole molecole non caratterizzate, è importante disporre di camici e guanti da laboratorio in quanto queste molecole non caratterizzate potrebbero essere potenzialmente pericolose.