Name: Large Scale Zebrafish-Based In vivo Screen piccole molecole (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Scopri lo screening su larga scala di piccole molecole in vivo utilizzando embrioni di Danio rerio. Questo metodo permette di identificare composti che modulano lo sviluppo embrionale e la fisiologia.

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1) Zebrafish Egg Collection <ol><li> Nel pomeriggio prima del giorno dello schermo chimica, istituito 10-20 vasche di allevamento pesce zebra. Riempire ogni serbatoio con acqua dal sistema di acquacoltura. Utilizzando una rete di pesce, il trasferimento di un maschio adulto e 1-2 femmine adulte di contenitore interno in ciascun serbatoio di allevamento. Separare i pesci di sesso maschile e femminile le une dalle altre con un divisore. Etichetta le gabbie e mettere un coperchio su di loro. </li><li> La mattina dello schermo, togliere i divisori da vasche di allevamento e permettere zebrafish per accoppiarsi. Nel corso del prossimo 1 ora, permettono uova fecondate di cadere in griglia nella parte inferiore di ogni contenitore interno. </li><li> Dopo 1 ora, il ritorno zebrafish adulto torna ai serbatoi di stoccaggio permanente, rimuovere il contenitore interno e raccogliere le uova da sforzare l&#39;acqua di ogni vasca da riproduzione attraverso un colino da tè di plastica. </li><li> Invertire il filtro su una piastra di Petri e risciacquare il filtro delicatamente per lavare le uova nella scatola di Petri utilizzando una bottiglia di lavaggio contenenti il ​​mezzo E3. </li><li> Tutte le uova non fecondate, che appaiono opache, deve essere rimosso con una pipetta di plastica monouso. Ogni croce accoppiamento dovrebbe produrre circa 200 embrioni. </li></ol> 2) arraying Embrioni in piastre da 96 pozzetti <ol><li> Trasferimento di circa 5 embrioni in media E3 in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta Pasteur di vetro. </li><li> Una volta che gli embrioni sono disposti sulla piastra a 96 pozzetti, rimuovere tanto del mezzo E3 possibile fuori dei pozzi con una a 12 canali (30 - 300 mL) pipetta, facendo attenzione a non forare l&#39;embrione. Utilizzando la pipetta a 12 canali, consegnare 250 microlitri di media E3 contenente kanamicina 0.5μg/ml in ogni pozzetto il più rapidamente possibile in modo da non permettere embrioni ad asciugarsi. </li><li> Mettere le piastre a 96 pozzetti in 28.5 ° C incubatore fino a raggiungere la fase desiderato quando i composti da aggiungere. </li></ol> 3) Trasferimento della Biblioteca piccole molecole Mentre il trasferimento composto può essere automatizzato con metodi di trasferimento robotica, verrà descritto il metodo manuale di trasferimento. <ol><li> Librerie di piccole molecole sono in genere forniti in un formato a 96 pozzetti, con ogni composto memorizzati in DMSO, secondo uno stock da 10 mm. Circa 60 minuti prima che gli embrioni raggiungere la fase in cui i composti sono da aggiungere, disgelo un numero desiderato di piastre a 96 pozzetti contenenti aliquote di piccole molecole (piatto di origine). Prendere nota del numero di identificazione di serie o altre piastre fonte. Per ridurre al minimo la condensazione sui piatti, scongelamento può avvenire in una camera di essiccazione contenente Drierite (WA HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH). </li><li> In breve spin down i piatti in una centrifuga da tavolo dotato di multi-bene adattatore piastra. </li><li> Rimuovere il sigillo di alluminio dalla piastra fonte. Usando una pipetta a 12 canali, diluire i composti nella piastra di origine alla concentrazione di 0,5 mm (per esempio, se partire con 250 aliquote nL 10 mM di brodo, aggiungere 4,75 ml di DMSO in ogni pozzetto). </li><li> Quando gli embrioni nella piastra a 96 pozzetti (piastra destinatario) raggiungono lo stadio desiderato, utilizzare un 12-canale (2-20 mL) pipetta per trasferire 2.5μL di composti (0,5 mm), dalle piastre di origine nel recipiente contenente le piastre embrioni. </li><li> Registrare il numero di identificazione della fonte piatti su piatti embrione del destinatario. Copertura piastre destinatario che ora contiene gli embrioni e composti con coperchi dolcezza mescolare le piastre rimestando delicatamente e metterli in una 28.5 ° C Incubatore. </li><li> Coprire ogni piatto di origine che contiene inutilizzati piccole molecole (0,5 mm) con un nastro di tenuta in alluminio e mettere in un congelatore ° -80 C per la conservazione a lungo termine. </li></ol> 4) Lo screening per gli effetti di piccole molecole mediante ispezione visiva delle Fenotipi <ol><li> Prima di eseguire lo schermo, formulare un criterio specifico per ciò che costituirebbe una &quot;hit&quot;. </li><li> A volte desiderato in fase di sviluppo, rimuovere le piastre a 96 pozzetti contenenti composto trattati con embrioni da incubatore ed esaminare ogni pozzetto sotto uno stereomicroscopio. Per una migliore visualizzazione dei cambiamenti sottili, come i cambiamenti nel modello circolatorio, un contrasto di fase microscopio invertito può essere utilizzato. Microscopia a fluorescenza può essere utilizzato per esaminare perturbazione di espressione di proteine ​​GFP o DsRed in un tessuto specifico promotore. </li><li> Analizzare rapidamente le piastre a 96 pozzetti per ogni bene in quali almeno 3 su 5 embrioni presentano le prescritte fenotipo &quot;hit&quot;. Registrazione dell&#39;identità della piastra e la posizione di ogni colpo ben potenziale. </li><li> Riconfermare un successo potenziale di ripetere le prove degli effetti del farmaco a dosaggi diversi (1 uM, 5 uM, 10 mM e 50 mM). Per ogni dose, 10 embrioni vengono testati in 0,5 ml di media E3 in un 48-ben formato piatto. I tempi di aggiunta composti per ripetere il test dovrebbe essere identica a quella della proiezione originale. Un colpo è confermata quando il fenotipo suscitato è riprodotto su una nuova determinazione della compound </li><li> Identificare il composto colpito dal database di piccole molecole in biblioteca chimica. </li></ol>

<ol><li>Bayliss, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modulation+of+receptor+signaling+inhibits+regenerative+angiogenesis+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Chemical modulation of receptor signaling inhibits regenerative angiogenesis in adult zebrafish.</a> Nature chemical biology. 2, 265-273 (2006).</li>
<li>Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+assay+for+small+molecules+that+modulate+zebrafish+embryonic+heart+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate.</a> Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).</li>
<li>Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+structure-activity+relationship+study+of+dorsomorphin+analogues+identifies+selective+VEGF+and+BMP+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo structure-activity relationship study of dorsomorphin analogues identifies selective VEGF and BMP inhibitors.</a> ACS chemical biology. 5, 245-253 (2010).</li>
<li>Hong, C. C., Peterson, Q. P., Hong, J. Y., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artery%2Fvein+specification+is+governed+by+opposing+phosphatidylinositol-3+kinase+and+MAP+kinase%2FERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Artery/vein specification is governed by opposing phosphatidylinositol-3 kinase and MAP kinase/ERK signaling.</a> Curr Biol. 16, 1366-1372 (2006).</li>
<li>Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+that+induce+repolarization+abnormalities+cause+bradycardia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish.</a> Circulation. 107, 1355-1358 (2003).</li>
<li>Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+developmental+screens+reveal+the+logic+and+timing+of+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12965-12969 (2000).</li>
<li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nature chemical biology. 4, 33-41 (2008).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature reviews. 4, 35-44 (2005).</li>
<li>Stern, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+that+delay+S+phase+suppress+a+zebrafish+bmyb+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Small molecules that delay S phase suppress a zebrafish bmyb mutant.</a> Nature chemical biology. 1, 366-370 (2005).</li>
<li>Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+suppression+of+a+genetic+mutation+in+a+zebrafish+model+of+aortic+coarctation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation.</a> Nature biotechnology. 22, 595-599 (2004).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Quando si pianifica un pesce zebra-based schermo chimica, particolare attenzione deve essere posta la robustezza del fenotipo in esame e il tasso di sfondo di tale fenotipo. Ciò è particolarmente importante per le schermate per soppressori chimica di un fenotipo indotto. Ad esempio, per un fenotipo causato da shock termico ad induzione di un transgene, la condizione che induce il fenotipo riproducibile deve essere tracciata con precisione prima di iniziare lo schermo per evitare i tassi di falsi positivi inaccettabilmen...

<ol><li> Minimo di 20 coppie di zebrafish adulti di genotipo desiderato. </li><li> Reti da pesca, vasche di allevamento, con contenitore interno estraibile e divisori (habitat acquatici). </li><li> Piastre di Petri (10 cm). </li><li> Colino da tè di plastica. </li><li> Lavaggio ad acqua embrione bottiglia containg. </li><li> Usa e getta in polietilene trasferimento pipette. </li><li> Polistirolo da 96 pozzetti a fondo rotondo piastre saggio (Corning COSTAR, Lowell, MA). </li><li> Pipetta Pasteur in vetro (Fisher Scientific). </li><li> Pompa manuale pipetta, 10 mL (Bel-Art Prodotti, Pequannock, NJ). </li><li> Embrione E3 media: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4, contenente 0,003% PTU (phenylthio-carbamide, Sigma, St. Louis, MO). PTU può essere preparato come soluzione 10x sciogliendo 0,3 g PTU in 1 L di media embrione E3. Le soluzioni contenenti PTU devono essere protetti dalla luce, coprendo con un foglio di alluminio. </li><li> 12-canale pipette, 2-20 microlitri (Eppendorf). </li><li> 12-canale pipette, 300-300 microlitri (Eppendorf). </li><li> Pipetta monouso in polistirolo bacino, 50 mL (Fisher Scientific). </li><li> Molecola piccola libreria di composti strutturalmente diversi disposte in un formato di 96-WLL a 10 magazzino mM in DMSO. Ogni piastra master è aliquotati nei piatti in polipropilene a 96 pozzetti di stoccaggio (Corning), e conservati a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Sigillabile alluminio nastro per piastre a 96 pozzetti (Nunc, Rochester, NY). </li><li> DMSO (Sigma, St. Louis, MO). </li><li> Incubatore di base, 28,5 ° C (Fisher Scientific). </li><li> Stereomicroscopio con base a luce trasmessa (Leica Microsystems, Bannockburn, IL). </li></ol>

large scale zebrafish-based in vivo screen piccole molecole

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Date le loro dimensioni embrione piccolo, rapido sviluppo, la trasparenza, la fecondità, e numerose somiglianze molecolari, morfologiche e fisiologiche per i mammiferi, zebrafish è emersa come un potente<em&gt; In vivo</emPiattaforma&gt; per il fenotipo a base di schermi di droga e analisi chimica genetica. Qui, abbiamo dimostrato un metodo semplice e pratico per lo screening su larga scala di piccole molecole usando embrioni di zebrafish.

Zebrafish è emersa come un potente<em&gt; In vivo</emPiattaforma&gt; per il fenotipo a base di schermi di droga e analisi chimica genetica. Qui, abbiamo dimostrato un metodo semplice e pratico per lo screening su larga scala di piccole molecole usando embrioni di zebrafish.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Screen piccole molecole

Date le ridotte dimensioni dell'embrione, lo sviluppo rapido, la trasparenza, la fecondità e le numerose somiglianze molecolari, morfologiche e fisiologiche con...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è scoprire molecole di piccole dimensioni che modulino in modo specifico aspetti chiave dello sviluppo embriogenetico e della fisiologia. Questo risultato si ottiene posizionando un elevato numero di uova fecondate in piastre da screening a 96 pozzetti come secondo passaggio. Aliquote di una libreria di molecole di piccole dimensioni vengono quindi aggiunte alle piastre a 96 pozzetti contenenti gli embrioni.Le piastre vengono esaminate per rilevare i fenotipi indotti dalle piccole molecole. Si ottengono risultati che mostrano quali piccole molecole influenzano specificamente lo sviluppo o la fisiologia del super pesce. Ciao, mi chiamo Charles Hong della School of Medicine della Vanderbilt University.Nel nostro laboratorio, eseguiamo schermate chimiche ad alto rendimento utilizzando embrioni di pesce zebra. Questa è una tecnica relativamente semplice che può essere ampiamente adattata per scoprire nuovi composti bioattivi. Nel pomeriggio precedente il giorno della schermata chimica, preparare da 10 a 20 vasche di riproduzione per pesci zebra.Inserire un divisorio in ciascun serbatoio e riempire ogni serbatoio con acqua dal sistema di acquacoltura utilizzando una rete da pesca, trasferendo un maschio adulto e una o due femmine adulte nel contenitore interno. In ciascun serbatoio di riproduzione, etichettare i serbatoi e coprirli con un coperchio la mattina dello screening. Rimuovere i divisorii dai serbatoi di riproduzione e permettere ai zebrafish di accoppiarsi.Nel corso dell'ora successiva, lasciare che le uova fecondate cadano attraverso la griglia situata nella parte inferiore di ogni contenitore interno. Dopo un'ora, restituire gli adulti di pesce sebra ai serbatoi di stoccaggio permanenti.Rimuovere il contenitore interno e raccogliere le uova filtrando l'acqua di ciascun serbatoio di allevamento attraverso un colino di plastica per tè. Capovolgere il colino su una piastra di Petri e risciacquare delicatamente il colino per far cadere le uova nella piastra. Utilizzando una bottiglia per lavaggio contenente mezzo E tre, rimuovere tutte le uova non fecondate, che appaiono opache.Utilizzando una pipetta di plastica monouso, ogni incrocio dovrebbe produrre circa 200 embrioni. Successivamente, trasferire circa cinque embrioni in mezzo E tre in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta di vetro Pasteur. Una volta che gli embrioni sono stati disposti sulla piastra a 96 pozzetti.Rimuovere con una pipetta a 12 canali la maggior quantità possibile di mezzo E three dalle pozzette, facendo attenzione a non perforare gli embrioni. Utilizzando la pipetta a 12 canali, aggiungere 250 microlitri di E three.Aggiungere rapidamente a ciascun pozzetto del mezzo contenente 0,5 microgrammi per millilitro di canamicina, per evitare che gli embrioni si secchino. Posizionare le piastre a 96 pozzetti in un incubatore a 28,5 gradi Celsius fino a quando gli embrioni non raggiungono lo stadio desiderato, momento in cui verranno aggiunti i composti. In questo protocollo, si ricercano composti in grado di alterare il patterning embrionale precoce e gli embrioni verranno incubati per tre ore o fino a quando oltre il 90% degli embrioni non avrà raggiunto lo stadio della mille cellule, come tipicamente fornito dalle librerie di molecole di piccole dimensioni.In una piastra sorgente a 96 pozzetti, con ciascun composto conservato in DMSO come soluzione madre da 10 millimolari, circa 60 minuti prima che gli embrioni raggiungano lo stadio desiderato scongelare un numero adeguato di piastre a 96 pozzetti contenenti aliquote di molecole di piccole dimensioni. Prendere nota del numero seriale o di altro codice identificativo delle piastre sorgente per ridurre al minimo la condensa sulle piastre. T cadere in una camera di essiccazione contenente essiccante.Centrifugare brevemente le piastre in una centrifuga da banco dotata di adattatore per piastre multipozzetta. Rimuovere il nastro in alluminio dalla piastra sorgente utilizzando una pipetta a 12 canali e diluire i composti nella piastra sorgente alla concentrazione desiderata con DMSO. In questo protocollo, utilizziamo una concentrazione finale di 0,5 millimolare e aggiungiamo 4,75 microlitri di DMSO per diluire la piastra madre da 10 millimolare.Quando gli embrioni nella piastra a 96 pozzetti raggiungono lo stadio desiderato, utilizzare una pipetta a 12 canali per trasferire 2,5 microlitri di composti dalle piastre sorgente alle piastre riceventi contenenti gli embrioni. Coprire le piastre contenenti ora gli embrioni e i composti con i coperchi e registrare il numero di identificazione delle piastre sorgente sulle piastre embrionali. Mescolare le piastre agitandole delicatamente e posizionarle in un incubatore a 28,5 °C.Coprire ogni piastra sorgente contenente piccole molecole non utilizzate con pellicola di alluminio e sigillare con nastro adesivo, quindi collocare in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine. Prima di eseguire lo screening visivo, definire un criterio specifico di risposta positiva. Ad esempio, in uno screening di inibitori a base di piccole molecole dello sviluppo del proencefalo, un risultato positivo può essere un composto che determina la perdita del proencefalo.L'assenza di occhi è un indicatore visivo semplice della perdita del proencefalo e non richiede l'uso di fluorescenza per essere valutata nei tempi desiderati dello sviluppo. Rimuovere le piastre a 96 pozzetti contenenti embrioni trattati con il composto dall'incubatore ed esaminare ogni pozzetto al microscopio stereoscopico durante lo screening di inibitori a piccole molecole dello sviluppo del proencefalo; esaminare le piastre a 28 ore per verificare la perdita dell'occhio come marcatore di inibizione dello sviluppo del proencefalo. Registrare l'identità della piastra e la posizione del pozzetto per ciascun pozzetto in cui almeno tre embrioni su cinque mostrano il fenotipo hi prescritto. Riposizionare la piastra a 96 pozzetti nell'incubatore.Riconfermare la perdita degli occhi e del proencefalo a 48 ore. Anche se gli embrioni non avranno un proencefalo, sopravvivranno almeno fino a quattro giorni. Riconfermare un potenziale risultato positivo ripetendo il test degli effetti del composto a diverse concentrazioni; per ciascuna concentrazione, si testano 10 embrioni in 0,5 millilitri di mezzo E3 in un formato di piastra a 48 pozzetti.Il momento dell'aggiunta del composto per il retest deve essere identico a quello della schermata iniziale. Un HIIT viene confermato quando il fenotipo osservato si riproduce in maniera dose-dipendente durante il retest del composto. Infine, identificare il composto hi dal database di molecole piccole presente nella libreria chimica.Utilizzando uno schermo chimico visivo basato sul pesce zebra, abbiamo scoperto un inibitore del segnale hedgehog a piccola molecola in base al suo effetto sull'asse corporeo. Questa immagine mostra embrioni esposti all'inibitore di hedgehog che presentano una marcata curvatura ventrale della coda. A 24 ore, gli stessi embrioni esaminati a 48 ore mostrano ancora il fenotipo con curvatura ventrale.Questa immagine mostra l'embrione trattato con il composto in confronto all'embrione mutante della via di segnalazione hedgehog. Una volta acquisita padronanza di questa tecnica, una persona può analizzare circa 400 composti a settimana in sole poche ore. Questa tecnica ha inoltre aperto la strada ai biologi chimici nello studio di fenomeni come lo sviluppo cellulare, le vie di segnalazione cellulare e lo sviluppo embrionale.Quando si lavora con piccole molecole non caratterizzate, è importante adottare adeguate misure di sicurezza, utilizzando camici da laboratorio e guanti, poiché queste molecole non caratterizzate potrebbero essere potenzialmente pericolose.

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Riportiamo lo sviluppo di un sistema automatizzato per l'imaging e l'analisi di zebrafish embrioni transgenici in piastre a pozzetti multipli. Questo dimostra la capacità di misurare gli effetti dose-dipendente di una piccola molecola, BCI, sull'espressione del gene del fattore di crescita dei fibroblasti giornalista e fornire tecnologia per stabilire high-throughput schermi chimici zebrafish.

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