Sviluppo di un approccio basato sulla microfluidica per lo studio della meccanica dei polimeri dei microtubuli

I microtubuli sono polimeri citoscheletrici che svolgono un ruolo essenziale nella divisione cellulare e nel trasporto intracellulare. In questo studio, adottiamo la microfluidica per studiare la meccanica dei microtubuli in vitro. Questo lavoro affronta due limitazioni specifiche per lo studio dei microtubuli nei dispositivi microfluidici, il potenziale di bolle d'aria, che possono denaturare le proteine e la mancanza di uso di saggi ad alto rendimento. Il nostro dispositivo microfluidico e il nostro protocollo consentono una gamma di configurazioni sperimentali con capacità di test ad alta produttività più robuste rispetto ai nostri precedenti saggi con celle a flusso.

[Istruttore] Per iniziare, il plasma pulisce un wafer di silicio da tre pollici sotto vuoto per cinque minuti utilizzando ossigeno o plasma di aria secca pulita. Assicurarsi che la pressione del vuoto sia inferiore a cinque volte dieci alla potenza di meno cinque torr. Centrare il wafer di silicio pulito sullo spin coder per la deposizione del fotoresist e depositare da uno a due millilitri di fotoresist SPR 227.0 al centro del wafer di silicio. Centrifugare il fotoresist per ottenere uno strato di 13 micrometri di spessore a 1000 giri al minuto per 30 secondi. Riducendo al minimo il contatto con la superficie rivestita, trasferire il wafer di silicio su una piastra calda impostata a 70 gradi Celsius. Incubare il wafer di silicio sulla piastra calda, aumentando la temperatura di 10 gradi Celsius ogni tre-cinque minuti fino a quando la temperatura raggiunge i 115 gradi Celsius. Quindi spegnere la piastra riscaldante e lasciare raffreddare il wafer di silicone fino a quando la sua temperatura non scende sotto i 65 gradi Celsius. Utilizzando una pinza, trasferire il wafer raffreddato nell'allineatore della maschera. Caricare sia il wafer di silicone che la maschera fotografica appropriata nell'allineatore secondo i protocolli del produttore o del sito specifico, ora esporre il wafer alle radiazioni ultraviolette con un'energia di circa 400 millijoule per centimetro quadrato. Calcolare il tempo di esposizione richiesto utilizzando la formula. Dopo la reidratazione e il trattamento termico, immergere il wafer nello sviluppatore appropriato. Quindi sciacquare delicatamente entrambi i lati del wafer con acqua deionizzata per 30 secondi. Dopo aver essiccato il wafer sviluppato utilizzando azoto gassoso, trasferirlo in un essiccatore. Metti un piccolo contenitore di alluminio nell'essiccatore e aggiungi una goccia di silano nel contenitore di alluminio. Dopo l'essiccazione, versare il polidimetilsilossano miscelato e degassato sullo stampo master all'interno di una capsula di Petri. Incubare la capsula a 65 gradi Celsius durante la notte per consentire alla PDMS di polimerizzare completamente. Intorno alle caratteristiche del dispositivo, utilizzare un bisturi o una lama di rasoio per ritagliare pezzi rettangolari di PDMS dallo strato master. Assicurarsi che ogni pezzo includa uno spazio di fiancheggiamento adeguato per consentire un contatto di incollaggio corretto e si adatti a un vetrino di 22 x 22 millimetri. Posizionare il PDMS su uno strato sacrificale di ricambio, evitando superfici dure. Quindi, utilizzando un perforatore pulito da 1,5 millimetri, praticare i fori di ingresso e di uscita in ciascun pezzo PDMS. Ora recupera un vetrino coprioggetto da 22 x 22 millimetri e puliscilo usando una salvietta imbevuta di alcol isopropilico. Quindi pulire al plasma il vetrino di copertura sotto vuoto per cinque minuti utilizzando plasma ad aria pulita e asciutta. Pulire sia il vetrino di copertura che il lato caratteristico del PDMS con salviette a base di alcol isopropilico prima di metterli entrambi nel pulitore al plasma e contemporaneamente pulirli al plasma per 30 secondi sotto vuoto utilizzando plasma ad aria pulita e asciutta. Dopo la pulizia, capovolgere il PDMS in modo che il lato delle funzioni sia rivolto verso il basso. Posizionare il PDMS sul vetrino coprioggetto e premere leggermente per favorire l'incollaggio. Le estensioni stabilizzate dei microtubuli sono state piegate facendo scorrere una soluzione tampone perpendicolare alla loro direzione di crescita, dimostrando la capacità di applicare una forza direzionale all'interno del dispositivo. La velocità del flusso vicino alla superficie sperimentata dai microtubuli è stata calcolata come 92 micrometri al secondo utilizzando la simulazione e la modellazione analitica basata sull'equazione di Navier-Stokes. Le simulazioni computazionali hanno dimostrato la creazione di gradienti stabili attraverso il dispositivo, confermati sperimentalmente da un colorante fluorescente che mostra modelli di concentrazione prevedibili. Estensioni dei microtubuli a doppia marcatura, partizionamento basato su gradiente confermato con diverse proteine fluorescenti che dominano in zone spaziali distinte lungo il dispositivo.