Name: Sviluppo di un approccio basato sulla microfluidica per lo studio della meccanica dei polimeri dei microtubuli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Scopri un approccio microfluidico per studiare la meccanica dei microtubuli in vitro. Questo metodo supera le limitazioni delle bolle d'aria e abilita test ad alto rendimento per la dinamica del citoscheletro.

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La microfluidica consente un controllo preciso di minuscoli volumi di fluido, spesso inferiori a un microlitro, mediante l'intricata progettazione e fabbricazione di canali di flusso del fluido 1,2. La piccola scala dei dispositivi microfluidici dà origine a fenomeni ingegneristici unici. Vale a dire, il numero di Reynolds - una misura adimensionale del rapporto tra forze inerziali e viscose nel flusso di fluidi - è piccolo, tipicamente dell'ordine di O(10) o inferiore in microfluidica, sottolineando l'importanza delle forze viscose nei dispositivi microfluidici. Inoltre, il numero di Péclet, che confronta il trasporto convettivo con quello diffusivo, mostra che il trasporto convettivo è generalmente trascurabile in microfluidica 3,4,5. Questo regime di flusso laminare guidato dalla diffusione in microfluidica è vantaggioso, in quanto supporta esperimenti paralleli su un singolo dispositivo mantenendo gradienti di fluido precisi.
La fotolitografia rimane il metodo principale per la fabbricazione di dispositivi microfluidici 6,7,8. In breve, questo processo prevede la creazione di un modello inciso "master" del progetto microfluidico (Figura 1). Viene preparato un substrato fotosensibile e una fotomaschera del design microfluidico espone selettivamente le aree di fotoresist alle radiazioni ultraviolette. I successivi metodi di incisione sviluppano il substrato, producendo un rilievo del disegno. Il polidimetilsilossano (PDMS) viene spesso colato e polimerizzato sul master. Il PDMS polimerizzato, che adotta le caratteristiche negative del design, viene quindi rimosso dal master e incollato a un vetrino coprioggetti. L'intero processo di fabbricazione richiede in genere 1-2 giorni, consentendo rapide iterazioni di progettazione e la produzione di più dispositivi. Recensioni dettagliate della litografia morbida e dei processi di microfabbricazione sono disponibili in altri riferimenti 1,2,3,10,11,12,13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68185/68185fig01.jpg"> 
Figura 1: Cenni sul processo di fotolitografia tradizionale e sul processo di microfabbricazione. (A) Processo di fotolitografia tradizionale e (B) processo di microfabbricazione. A seconda dell'applicazione e delle caratteristiche desiderate del fotoresist, è possibile utilizzare un fotoresist negativo o positivo, anche se produrranno lo stesso master di progettazione. Caratteristiche come l'altezza desiderata o la temperatura di fusione del fotoresist aiutano a determinare il tipo di fotoresist appropriato. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Rogers (2022)14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68185/68185fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
L'uso della microfluidica ha ampliato le possibilità in molti campi di ricerca, con il suo impatto più recente nelle scienze biologiche. Data la sua piccola scala, la microfluidica consente la gestione precisa di risorse limitate e preziose come cellule o proteine. Ancora più incisiva è la capacità dei sistemi microfluidici di imitare le condizioni fisiologiche, come le modifiche nella rigidità del substrato, l'esercizio di forza su un campione e persino l'integrazione della corrente elettrica. Inoltre, l'uso della microfluidica offre la possibilità di manipolare più reagenti in parallelo e di prototipare rapidamente e perfezionare iterativamente i progetti di sistema. Queste caratteristiche consentono la miniaturizzazione di interi flussi di lavoro di laboratorio su un unico dispositivo, comunemente noto come "lab-on-a-chip"1,6,9,15,16,17,18,19.
Una delle applicazioni biologiche cellulari della microfluidica è lo studio dei polimeri dei microtubuli. I microtubuli sono un componente essenziale del citoscheletro della cellula, svolgendo un ruolo vitale in processi come la divisione cellulare e il trasporto intracellulare del carico20,21. Essendo l'elemento più rigido del citoscheletro, i microtubuli presentano un modulo elastico paragonabile a quello del Plexiglass22,23. Le loro robuste proprietà meccaniche sono cruciali per varie funzioni cellulari, tra cui, ad esempio, la contrazione dei cardiomiociti, dove si piegano e si rilassano ciclicamente durante le fasi sistolica e diastolicadel cuore 24. I dispositivi microfluidici sono stati precedentemente adottati per studiare le proprietà dei microtubuli e le loro strutture di ordine superiore in vitro. Infatti, la microfluidica è stata utilizzata per sondare le dinamiche di polimerizzazione dei microtubuli, le interazioni microtubuli-microtubuli e gli effetti delle proteine associate ai microtubuli sulle proprietà meccaniche dei microtubuli 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41.
Sebbene l'introduzione della microfluidica nel campo dei microtubuli abbia portato a molte scoperte entusiasmanti, c'è ancora spazio per migliorare l'adattamento di questi dispositivi per la ricerca sui microtubuli. In questo lavoro, affrontiamo due limitazioni specifiche che persistono nello studio dei microtubuli nei dispositivi microfluidici: il potenziale di formazione di bolle d'aria all'interno del dispositivo, tipicamente introdotto dalla manipolazione manuale dei dispositivi microfluidici, e il sottoutilizzo dei saggi ad alto rendimento. Innanzitutto, le manipolazioni manuali, come l'ostruzione e lo scollegamento dei tubi, possono introdurre la formazione di bolle nei canali. La formazione di bolle d'aria all'interno di una cella a flusso è catastrofica, poiché le bolle d'aria possono denaturare le proteine, tagliare i polimeri dei microtubuli e influenzare negativamente le colture cellulari42,43. Inoltre, gli angoli acuti e gli angoli obliqui nel dispositivo provocano una bagnatura superficiale non uniforme, aumentando la possibilità di trascinamento dell'aria. Numerose tecniche sono state sviluppate per ridurre la formazione, la persistenza e l'impatto delle bolle d'aria; Tuttavia, l'uso di metodi di mitigazione delle bolle non è universale 42,43,44,45,46. Inoltre, sebbene uno dei principali vantaggi dell'utilizzo della microfluidica sia la capacità di sperimentazione ad alto rendimento, la microfluidica non è ancora stata utilizzata per aumentare la ricerca sui microtubuli. I dispositivi microfluidici possono essere progettati per testare più condizioni sperimentali in parallelo sullo stesso dispositivo. Ad esempio, i gradienti di fluido possono essere utilizzati per dirigere il flusso di diverse proteine o farmaci associati ai microtubuli, consentendo la loro somministrazione mirata a regioni specifiche di microtubuli partizionati all'interno dello stesso dispositivo.
In questo caso, abbiamo progettato in modo iterativo un dispositivo microfluidico che affronta queste limitazioni. Forniamo il protocollo passo dopo passo per la fabbricazione del dispositivo, consentendo così a un pubblico più ampio di utilizzare la tecnologia microfluidica nella ricerca sui microtubuli. Il design di questo dispositivo incorpora funzioni di intrappolamento delle bolle e utilizza un sistema di controllo del flusso automatizzato per ridurre l'intervento manuale, consentendo al contempo gradienti di soluzioni nel dispositivo per analisi ad alta produttività. In sintesi, lo sviluppo di questo design microfluidico può facilitare una ricerca e una comprensione più ampie della meccanica dei microtubuli, offrendo al contempo preziosi miglioramenti ai progetti sperimentali nel più ampio campo di ricerca sui microtubuli.

<table><tbody><tr><td>Provette per microcentrifuga da 0,6 mL (trasparenti)</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>È preferibile il tipo a bassa ritenzione</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 mL (trasparenti)</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>È preferibile il tipo a bassa ritenzione</td></tr><tr><td>Punzone per biopsia standard da 1,5 mm</td><td>Integra LifeSciences</td><td>33-31A-P/25</td><td></td></tr><tr><td>100x/1,49 Obiettivo TIRF ad apertura numerica</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm vetrini coprioggetti</td><td>ThorLabs</td><td>CG15CH</td><td></td></tr><tr><td>3" wafer di silicone lucido su un lato</td><td>University Wafer</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>4" piastra Petri</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>450 &micro; L, tubo ultra-trasparente a parete sottile open-top</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>345843</td><td>Indicato come "tubo airfuge" nel protocollo</td></tr><tr><td>488-, 561 e 640-nm laser a stato solido</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A-95 Fixed-Angle Rotor</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>347595</tr><tr><td>Acetone</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Airfuge Ultracentrifuga ad aria compressa</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>347854</td><td>Indicato come "airfuge" nel protocollo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Microscale Protein Labeling Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A30006</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di alluminio</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor iXon Ultra EM-CCD</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor NEO sCMOS</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk</td><td></td><td>Versioni generiche può essere utilizzato</td></tr><tr><td>Cervello bovino tubulina non marcata (purificata)</td><td>N/A Prodotto</td><td></td><td>in casa, ma può essere acquistato</td></tr><tr><td>Caseina</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>Catalasi</td><td>MilliporeSigma</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Aria secca pulita (CDA) (gas pressurizzato)</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alimentazione di aria compressa</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>Si collega al microfluidico controllore di portata</td></tr><tr><td>COMSOL Software multifisico</td><td>COMSOL, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adattatore per tavolino in ottone personalizzato</td><td>N/A Realizzato</td><td></td><td>in casa per adattarsi ai nostri vetrini coprioggetti da 22 mm x 22 mm sul microscopio</td></tr><tr><td>Acqua deionizzata</td><td>Disidratatore di qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>MilliporeSigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Software MilliporeSigma</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>Elveflow Smart Interface (ESI)</td> Raccordi PFA senza flangia <td>Elveflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>con ETFE &frac14; "Da -28 a 1/16" boccole diametro esterno&nbsp;</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>CIL-XP-245X</td><td>Utilizzato per collegare il tubo dalle fiale di origine micrewtube al sensore di flusso tramite il rack del serbatoio pressurizzato</td></tr><tr><td>Fluiwell a 4 canali 2 mL</td><td>14002001</td><td>fluorescente</td> a bassa pressione <td>Utilizzato per collegare il sistema di controllo del flusso alle micrewtubes. Indicato anche come "rack serbatoio pressurizzato"</td></tr><tr><td>Cappa aspirante</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucosio ossidasi</td><td>MilliporeSigma</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-405L</td><td></td></tr><tr><td>Guanosina trifosfato (GTP)</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HS-625 ad alta velocità ruota portafiltri di emissione</td><td>Finger Lakes Strumentazione</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>N/A Accesso</td><td></td><td>aperto</td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropilico</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karl Suss MA-6 allineatore</td><td>maschera SUSS MicroTec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.05833</td><td></td></tr><tr><td>Software MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAPOSIT SPR 220 7.0 fotoresist</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit adattatori Raccordi Microfluidici da 6-40 a 1/4"-28</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>LVF-KFI-08</td><td>Utilizzato per collegare il tubo dalle fiale sorgente micrewtube al sensore di flusso tramite il rack del serbatoio pressurizzato (rack Fluiwell)</td></tr><tr><td>Raccordi Microfluidici Kit adattatore Luer Lock femmina</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>LVF-KFI-04</td><td>Utilizzato per collegare la siringa al tubo Regolatore</td></tr> <tr><td></td><td>di flusso microfluidicoElveflow</td><td>OB1 MK3+</td><td></td></tr><tr><td>Sensore di flusso microfluidico</td><td>Elveflow</td><td>MFS3</td><td>Questo intervallo del sensore di flusso è 0-80 &mu; L&nbsp;</td></tr><tr><td>Sviluppatore MICROPOSIT MF-319</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements software</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azoto (gas pressurizzato)</td> <td>Qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Riscaldatore obiettivo</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Raccordo conico a tenuta di dita 10-32 monopezzo per tubi da 1/16" OD&nbsp;</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>CIL-F-120X</td><td>Utilizzato per collegare la siringa al tubo</td></tr><tr><td>Paclitaxol (Taxol)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1097</td><td></td></tr><tr><td>Maschere per fotolitografia</td><td>N/A Realizzato</td><td></td><td>da una parte esterna utilizzando i nostri disegni</td></tr><tr><td>TUBI Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>172615000</td><td></td></tr><tr><td>Detergente al plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di flussimetri al plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-FMG</td><td>Si integra con il pulitore al plasma per consentire il controllo del flusso di gas pressurizzato</td></tr><tr><td>Pipetta a bulbo in plastica</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluoronic F-127</td><td>MilliporeSigma</td><td>P2443</td><td>Indicato come "poloxomer 407" nel protocollo</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Research Products International</td><td>P41000</td><td></td></tr><tr><td>Plastiche ad alte prestazioni Saint Gobain&nbsp; Tubo Tygon .020 ID</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-206-8921</td><td>Indicato come "tubo da 1,5 mm" e "tubo" nel protocollo</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Cost Effective Equipment, LLC.</td><td>200x</td><td>Questo modello potrebbe essere fuori produzione</td></tr> Set <tr><td>di pipette e punte standard</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringa in plastica standard</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>Abbiamo usato una siringa Luer-slip da 10 ml</td></tr><tr><td>Kit di elastomero siliconico Sylgard 184</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td>Indicato come "PDMS" e "agente indurente" nel protocollo</td></tr><tr><td>T339 Micrewtube con guarnizione a labbro e tappo a vite piatto</td><td>Medline Industried, LP.</td><td>T339</td><td>Indicato come "fiala di origine" nel protocollo. Abbiamo utilizzato entrambe le dimensioni da 0,5 mL e 1,5 mL</td></tr><tr><td>TAMRA, SE; 5-(e-6)-Carbossitetrametilrodamina, Succinimidil Estere</td><td>Invitrogen</td><td>C1171</td><td>Indicato come 'TTR' nel protocollo</td></tr><tr><td>Tricloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil) silano</td><td>MilliporeSigma</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>Trion Phantom RIE ICP&nbsp;</td><td>Tecnologia Trion, Inc.</td><td></td><td>Questo pulitore al plasma viene utilizzato solo nel passaggio 1.1 del protocollo. Al suo posto si può utilizzare un altro pulitore al plasma, come quello utilizzato per l'incollaggio PDMS; preferiamo solo il vuoto molto più basso raggiungibile da questo sistema per la pulizia del wafer di silicio</td></tr><tr><td>TRITC Anticorpo policlonale Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A6397</td><td>Indicato come "anticorpo anti-rodamina" nel protocollo</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa a vuoto</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sviluppo di un approccio basato sulla microfluidica per lo studio della meccanica dei polimeri dei microtubuli

Development of a Microfluidics-Based Approach for Investigating Microtubule Polymer Mechanics

Sviluppo di un approccio basato sulla microfluidica per lo studio della meccanica dei polimeri dei microtubuli

In this protocol, we describe the design and fabrication of a microfluidic device developed for the investigation of microtubule polymer mechanics. The ...

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Bioengineering

Bioingegneria

Vi presentiamo una procedura per la formazione di un poli (glicole etilenico) auto-assemblati monostrato (PEG-SAM) su un substrato di silicio con microelettrodi d'oro. Il PEG-SAM è formato in un unico passaggio ed evita biofouling sulle superfici di silicio e oro. Elettroforesi viene quindi utilizzato per biomolecole patterning fino alla scala nanometrica.

Antivegetativa monostrati auto-assemblati su microelettrodi per Biomolecole Patterning

Un metodo per misurare la lunghezza di persistenza o rigidezza flessionale di biopolimeri è descritto. Il metodo utilizza una chinesina-driven saggio microtubuli planata per determinare sperimentalmente la lunghezza di persistenza di microtubuli singoli ed è adattabile a actina saggi basati scorrimento.

Misure rigidezza flessionale di biopolimeri usando saggi Gliding

I microtubuli sono intrinsecamente polimeri instabili, e il loro passaggio tra la crescita e l'accorciamento è stocastico e difficile da controllare. Qui si descrivono i protocolli utilizzando microtubuli segmentato con tappi di stabilizzazione photoablatable. Depolimerizzazione dei microtubuli segmentati può essere attivato con alta risoluzione temporale e spaziale, aiutando in tal modo l'analisi delle proposte di risoluzione con lo smontaggio estremità del microtubulo.

Preparazione di segmentate microtubuli allo Studio Proposte guidato dal Smontaggio microtubuli Ends

Erba lievito è un modello vantaggioso per lo studio della dinamica dei microtubuli in vivo grazie ai suoi potenti genetica e la semplicità della sua citoscheletro microtubuli. Il seguente protocollo descrive come trasformare le cellule e la cultura di lievito, di acquisire immagini di microscopia confocale, e quantitativamente analizzare dinamica dei microtubuli in cellule di lievito viventi.

Ad alta risoluzione Imaging e analisi dei singoli microtubuli astrali Dynamics in germogliamento lievito

Qui presentiamo un metodo robusto e dettagliato di analisi delle dinamiche dei microtubuli nelle cellule sincronizzate nella prometafase utilizzando la microscopia confocale del disco di filatura a cellule vive e l'elaborazione delle immagini basata su MATLAB.

Misurazione della microtubule Dynamics mediante microscopia disco rotante in spindle mitotici monopolari

Qui, viene presentato un test di ricostituzione in vitro basato sulla microscopia TIRF per quantificare e confrontare contemporaneamente la dinamica di due popolazioni di microtubuli. Viene descritto un metodo per visualizzare simultaneamente l'attività collettiva di più proteine associate a microtubuli su fasci di microtubuli reticolati e singoli microtubuli.

Visualizzazione simultanea della dinamica di microtubuli reticolati e singoli in vitro mediante microscopia TIRF

Presentiamo un protocollo per l'implementazione della microscopia a riflessione di interferenza e della microscopia a riflessione totale interna-fluorescenza per l'imaging simultaneo di microtubuli dinamici e proteine associate a microtubuli marcati fluorescenti.

Microscopia a fluorescenza a riflessione interna simultanea e riflessione interna totale per l'imaging di microtubuli dinamici e proteine associate

Qui, presentiamo un protocollo per ricostituire i fasci di microtubuli in vitro e quantificare direttamente le forze esercitate al loro interno utilizzando l'intrappolamento ottico simultaneo e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Questo test consente la misurazione su scala nanometrica delle forze e degli spostamenti generati dagli insiemi proteici all'interno delle reti di microtubuli attivi.

Misurazione diretta delle forze all'interno di fasci di microtubuli attivi ricostituiti

Presentiamo protocolli per semplici saggi microfluidici di filamenti di actina, in combinazione con la microscopia a fluorescenza, che consentono di monitorare con precisione i singoli filamenti di actina in tempo reale esponendoli sequenzialmente a diverse soluzioni proteiche.

Utilizzo della microscopia a microfluidica e fluorescenza per studiare la dinamica di assemblaggio di singoli filamenti e fasci di actina

Questo articolo presenta un protocollo per la formazione di assemblaggi di microtubuli a forma di tactoidi utilizzando MAP65, un reticolante di microtubuli a base vegetale e PEG come agente di affollamento.

Auto-assemblaggio di microtubuli tactoidi

Questo protocollo è una guida per la visualizzazione dinamica di actina e microtubuli utilizzando un test di microscopia a fluorescenza interna totale (TIRF) in vitro .

Visualizzazione delle dinamiche di accoppiamento di actina e microtubuli in vitro mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)

Scopri un approccio microfluidico per studiare la meccanica dei microtubuli in vitro. Questo metodo supera le limitazioni delle bolle d'aria e abilita test ad alto rendimento per la dinamica del citoscheletro.

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