Microdissezione da cattura laser del tessuto epatico di topo fissato con paraformaldeide per l'analisi dell'RNA

La nostra ricerca indaga principalmente la fisiopatologia correlata agli epatociti nel contesto delle malattie croniche del fegato. Questo protocollo consente l'isolamento cellulare nelle fette di tessuto epatico e l'estrazione di RNA. A differenza del protocollo FFPE, o Paraformaldehyde-fixed o CT preserva e itegrida, consentendo una micro-discussione precisa e campioni di alta qualità per l'analisi OMI a valle.

Per iniziare, esporre le vetri della membrana della penna alla luce ultravioletta in quattro minuti e 30 minuti. Ricoprire le vetri con 0,1 milligrammi per millilitro di polilisina L e lasciarle asciugare all'aria. Sigillare i bordi di ogni carrello con un mezzo di montaggio neutro.

Utilizzando un agente di decontaminazione RNasi, pulire tutte le superfici accessibili del criostato e di tutti gli strumenti. Uso il 75% di etanolo. Pulisci accuratamente il pennello e gli attrezzi.

Ora, imposta la temperatura del criostato a meno 20 gradi Celsius e lascia che si stabilizzi. Recupera i campioni di fegato da una stoccaggio a meno 80 gradi Celsius. Inserire i campioni nella camera criostatica per almeno 15 minuti per stabilizzarli.

Applicare uno strato spesso da due a tre millimetri di composto OCT sulla fase del campione. Poi posiziona la fase del campione su una rapida mensola libera o all'interno della camera criostatica per pre-solidificare lo strato composto. Dopo aver applicato una piccola quantità di composto OCT sullo strato pre-solidificato, posiziona orizzontalmente il blocco di tessuto equilibrato sul composto e mantieni fermo per 10-15 secondi.

Successivamente montare lo stadio del campione con il blocco di tessuto attaccato sulla testa del campione criostatico. Ora inserisci la lama con attenzione tra le piastre di serraggio e le piastre posteriori da un lato del criostato. Clampa la leva di serraggio per fissare la lama.

Regola lo spessore del criostato a 10 micrometri. Taglia il tessuto in sezioni e montale direttamente sulle lamine a membrana pretrattate all'interno della camera criostatica, mantenute a meno 20 gradi Celsius. Scongelare i vetri a temperatura ambiente per 20 minuti.

Lava i vetri tre volte con PBS libero RN ACE per quattro giorni da 10 secondi per ogni lavaggio. Aggiungi la soluzione filtrata di ematossilina di Mayer sulle sezioni del tessuto per cinque-dieci secondi. Poi lava i vetri tre volte con acqua priva di ribonucleasi per 10 secondi a ogni lavaggio per rimuovere residui di ematossilina.

Valuta la qualità della colorazione al microscopio. Usando carta assorbente, asciuga le vetrine e lasciale asciugare completamente all'aria. Pulire la superficie del banco di laboratorio con un agente di decontaminazione RNasi.

Accendi il controller e lascia che il microscopio completi l'inizializzazione. Ruota la chiave in senso orario dalla posizione spenta a quella accesa per avviare il sistema laser. Accendi il computer e avvia il software di micro-dissezione a cattura laser.

Poi aspetta che l'inizializzazione si completi. Ora inserisci un tubo sterile da 0,2 millilitri per PCR nel dispositivo di raccolta. Usando una pipetta, aggiungi 10 microlitri di proteasi K tampone di digestione al tappo del tubo PCR.

Carica il dispositivo di raccolta nel portacampioni del microscopio. Nella finestra del dispositivo di cambio collezione. Vai a regolare il punto di riferimento, regola la messa a fuoco della fotocamera per vedere chiaramente il punto di riferimento e usa i controlli delle frecce per centrarlo se necessario.

Carica una sezione di tessuto nel portacampioni con il tessuto rivolto verso il basso e la posizione dell'etichetta a destra. Seleziona la lente oggettiva 10 x e identifica le regioni di interesse con caratteristiche patologiche specifiche. Naviga al menu laser.

Clicca su calibra, seleziona sì e completa la calibrazione. Nel pannello di controllo laser, imposta la potenza laser a 50, apertura a cinque e velocità a nove. Poi usa la barra grafica per disegnare un cerchio intorno all'area di destinazione.

Seleziona una singola forma, premi start cut per eseguire una micro-dissezione a cattura laser e posiziona il dispositivo di raccolta per raccogliere il tessuto dissezionato. Per catturare documentazione, immagini, seleziona file e scegli di salvare immagini da salvare prima e dopo nel formato preferito. Dopo aver raccolto le celle desiderate, clicca su scarica per rimuovere il collettore dallo stage.

Verifica che 10 microlitri di buffer di digestione proteasi K rimangano nel tappo e reintegra se necessario. Chiudi il tubo e vortizza accuratamente. Poi fai ruotare brevemente il tubo in una centrifuga.

Conserva il tubo a meno 80 gradi Celsius fino all'estrazione dell'RNA. La sezione epatica colorata con ematossilina sul vetrino della penna è stata visualizzata al microscopio prima e dopo la microdissezione a cattura laser. Le regioni di interesse che mostrano steatosi microvescicolare sono state raccolte con precisione nel tappo del tubo A PCR.

Preservare la morfologia cellulare intatta. L'acido ribonucleico totale estratto da circa 1000 e 2000 cellule isolate di microdissezione a cattura laser ha prodotto rispettivamente 110,7 nanogrammi e 213,3 nanogrammi. Tutti i campioni hanno mostrato un'alta purezza con rapporti di assorbimento di 260 per 280 nanometri compresi tra 1,9 e 2,1.

L'elettroforesi in gel ha rivelato bande ribosomiche di acidi ribosomici 28 s e 18 s. Profili bioanalizzatori di acido ribonucleico da appena 1000 cellule. Ha dato un valore di integrità dell'acido ribonucleico di 6,7.

Q-R-T-P-C-R per il gene di mantenimento Beta actin ha prodotto valori di soglia ciclica variabili da 17 a 19. La valutazione da bioanalizzatore delle librerie di sequenziamento costruite da 50 nanogrammi di acido ribonucleico totale ha mostrato un picco caratteristico tra 300 e 500 coppie di basi. Il sequenziamento a RNA di queste librerie ha prodotto dati di alta qualità sia con punteggi Q 20 che Q 30, superando il 90% e un basso tasso di errore tra replicate.

Una considerazione importante è prevenire l'anti-degradazione tramite il controllo della cessazione, la colorazione rapida e condizioni dritte durante la nostra lavorazione. Ordinato questa procedura, può essere utilizzata per PCR in tempo reale e sequenziamento con chiavi di libreria ottimizzate per frammentazione. Stabilito in campioni di fegato.

Questo protocollo consente la profilazione dei sottogruppi epatociti e supporta la ricerca epatologica focalizzata sulla patologia.