Laser-capture Microdissezione di Human prostatica Epitelio per l'analisi di RNA

L'obiettivo generale di questo protocollo di microdissezione con cattura laser è isolare l'RNA totale da popolazioni purificate di tipi cellulari epiteliali prostatici ottenute da tessuti prostatici congelati eterogenei, per analisi successive dell'espressione genica. Questo metodo può aiutare ad analizzare campioni di pazienti e rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sul cancro alla prostata, come ad esempio in che modo l'espressione dell'RNA differisce tra campioni di tessuto epiteliale benigno e patologico, oppure tra campioni provenienti da studi clinici. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la microdissezione con cattura laser consente l'isolamento di RNA da popolazioni omogenee di cellule epiteliali o stromali a partire da tessuto prostatico congelato.

Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà nell'ottenere RNA di alta qualità perché non sanno quali passaggi siano critici per mantenere gli RNA. Condizioni libere Iniziare raccogliendo tutti i reagenti e gli strumenti necessari per la procedura. Dopo aver lasciato equilibrare il tessuto prostatico congelato all'interno del criostato per 30 minuti, versare del mezzo di montaggio sul fondo della cassetta e montare rapidamente il tessuto utilizzando pinzette fredde.

Posizionare la cassetta nel refrigeratore del criostato per cinque minuti per fissare il mezzo di montaggio. Una volta indurito, versare del mezzo di montaggio congelato sul portacampioni e premere delicatamente il tessuto montato al suo interno, con il lato inferiore rivolto verso l'alto.

Lasciare riposare il preparato per cinque minuti. Prima di posizionare il mandrino nel supporto, bloccare la manopola in posizione e inserire una nuova lama nel criostato. Dopo aver sbloccato la manopola, avanzare con attenzione il campione fino a raggiungere l'esposizione del tessuto desiderata.

Quando pronto, regolare il criostato a cinque micron e tagliare una o due sezioni. Posizionare queste sezioni su un vetrino carico per la colorazione con ematina ed eosina. Immergere immediatamente il vetrino in etanolo freddo al 100% per due minuti.

Dopo questo periodo, rimuovere il vetrino e farlo asciugare a temperatura ambiente. Il vetrino colorato con ematossilina ed eosina consente una migliore visualizzazione delle texture nucleari e deve essere utilizzato dal patologo per delimitare le aree di interesse. Successivamente, posizionare un telaio a pennarello a temperatura ambiente.

Posizionare nel supporto per vetrini, regolare il criostato a 10 micron e produrre sezioni. Da una a quattro sezioni possono essere posizionate su ciascun vetrino, a seconda delle dimensioni del tessuto. Immergere immediatamente il vetrino in etanolo freddo al 100%.

Rimuovere il vetrino dopo due minuti e conservarlo nel congelatore per un'analisi successiva. Nello stesso giorno della microdissezione con laser, recuperare i vetrini con telaio da disegno dal congelatore operando in un'area libera da RNA. Idratare i vetrini immergendoli delicatamente in etanolo al 90% per due minuti, quindi in etanolo al 75% per due minuti.

Dopo l'idratazione, colorare il tessuto prostatico immergendo delicatamente i vetrini in una soluzione di blu di toina allo 0,5% per un tempo compreso tra cinque e 30 secondi. Fissare il tessuto lavando i vetrini due volte in acqua distillata per 15 secondi, seguiti da etanolo al 75% per 30 secondi fino a tre minuti. Infine, trasferire i vetrini con la cornice a pennarello in un contenitore asciutto privo di RNA e collocarlo sul ghiaccio.

Prima di iniziare la procedura, posizionare un vetrino ad asciugare su un riscaldatore per vetrini per 15 minuti. Asciugare solo il vetrino che verrà processato e conservare gli altri sul ghiaccio fino al momento dell'uso. Accendere i componenti del microdissezione laser nell'ordine seguente.

Accendere il microscopio, la chiave del laser, l'interruttore del laser e quindi il computer. Successivamente, avviare il software di microdissezione laser utilizzando il software. Richiedere al microscopio di caricare i vetrini e i tubi di raccolta.

Fare clic su "scarica portacampioni" e caricare il vetrino sul portacampioni con il tessuto rivolto verso il basso. Inserire il portacampioni nella fessura appropriata del microscopio e fare clic su "continua". Successivamente, fare clic su "scarica provette di raccolta".

Etichettare e posizionare i tubi sul portatubi e inserirli nello slot appropriato. Chiudere i tappi e aggiungere 35 microlitri di buffer di lisi, avendo cura di evitare bolle.

Dopo aver caricato i tappi di raccolta, fare clic su OK. Utilizzare il software per selezionare la posizione del vetrino nel supporto, quindi scegliere il tappo di raccolta per prelevare il campione. Visualizzare e mettere a fuoco il vetrino attraverso il computer con un ingrandimento di 10 x.

Utilizzare il software per calibrare il laser selezionando laser. Quindi calibrare, regolare l'apertura della potenza e la velocità del laser selezionando laser e successivamente controllo. Continuare ad apportare regolazioni finché il laser non taglia completamente il tessuto.

È fondamentale delimitare le aree di interesse, un'operazione solitamente eseguita da un patologo certificato, al fine di dissezionare con precisione le aree desiderate del tessuto sottoposto a LCM utilizzando come guida visiva la marcatura istologica su vetrino 8 x 11 pollici con ematossilina ed eosina. Utilizzare lo strumento di disegno delle forme nel software per delimitare le aree desiderate di epitelio nella vista, evitando di raccogliere qualsiasi stroma. Fare clic su "taglia" per avviare il laser.

Se un'area non è stata tagliata completamente, utilizzare lo strumento di spostamento e taglio per ripassarla manualmente. Continuare a spostare l'obiettivo verso nuove aree e ripetere il taglio laser fino a quando il vetrino non è completamente dissezionato o non è stata raccolta la quantità desiderata di tessuto. Al termine, rimuovere con attenzione i tubi dal supporto di raccolta e chiudere i tappi facendo attenzione al lisato, al tampone e al tessuto presenti nei tappi.

Brevemente, centrifugare per 30 secondi per raccogliere il liquido e il tessuto sul fondo del tubo. Incubare i campioni a 42 gradi Celsius per 30 minuti e conservare a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'isolamento dell'RNA. Questi esempi mostrano sezioni representative della prostata colorate con blu di toluidina su vetrino con cornice a penna, prima e dopo l'acquisizione laser di controlli specifici per il tipo cellulare dell'epitelio benigno.

Verificare la specificità dell'area del tessuto catturata con il laser. Epitelio e stroma benigni. Non esprimono il gene specifico del cancro alla prostata, A-M-A-C-R.

Lo stroma non esprimeva il gene specifico epiteliale e KX 3.1 durante il tentativo di questa procedura. È importante ricordare di lavorare in un ambiente privo di RNA per prevenire la degradazione dell'RNA. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare l'RNA da popolazioni omogenee di cellule epiteliali o stromali da tessuto congelato per numerose tecniche di analisi successiva.

Non dimenticare che lavorare con un criostato può essere estremamente pericoloso; pertanto, precauzioni come una buona formazione e un'attenzione estremamente accurata alla lama devono sempre essere osservate durante l'esecuzione di questa procedura.