Name: Laser-capture Microdissezione di Human prostatica Epitelio per lanalisi di RNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Impara la microdissezione laser-capture per isolare RNA da popolazioni pure di epitelio prostatico in campioni congelati eterogenei. Questo metodo supporta l'analisi dell'espressione genica nella ricerca sul cancro della prostata.

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Ringraziamo la dottoressa Vicky Macias, Angeline Giangreco e Avani Vaishnav per l'assistenza nell'ottimizzazione di questa metodologia nel corso degli anni e Yang Zhang e il dottor Jian Ma dell'Università dell'Illinois a Urbana-Champaign per l'analisi del seq dell'RNA. Questo lavoro è stato supportato da NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) e una sovvenzione della Prevent Cancer Foundation (Zhou).

Tutti i tessuti umani usati per questi esperimenti sono stati acquisiti tramite un protocollo Institutional Review Board approvato e / o di esenzione presso University of Illinois a Chicago. 1. Sezione freschi congelati prostata su PEN-scivolo e sulla Charged vetrino <ol><li> Il giorno prima o qualche ora prima sezionare il campione, attrezzi puliti (ad esempio, spazzola, pinze, coplins, lame, scivoli PEN-incorniciati (se non è già RNasi gratuito), un ETOH marcatore di sicurezza e una matita) e l&#39;interno di una RT criostato con la soluzione RNase-decontaminazione utilizzando uno spray e di laboratorio-salviette. <ol><li> Lasciare la soluzione-RNasi decontaminazione a sedere per 5 minuti prima asciugandosi, sciacquare con depcH 2 0 da rimuovere sinistra su una soluzione e un risciacquo finale con il 70% EtOH (preparato con depcH 2 0) RNasi-decontaminazione. Nota: E &#39;essenziale mantenere uno spazio di lavoro RNasi-free. Tutti coplins, strumenti, mezzo di montaggio congelato, lame e diapositive usati devono essere utilizzati solo per RNasi lavoro gratise mai usato in un ambiente privo di serie non RNasi. Tutti gli strumenti devono essere trattati con una soluzione di decontaminazione RNasi prima di ogni esperimento. </li></ol></li><li> Raffreddare criostato a -24 ° C. </li><li> Posizionare i seguenti puliti strumenti gratuiti RNasi all&#39;interno criostato raffreddare almeno 30 minuti prima di sezionamento: slide Coplin-riempita con 100% di etanolo, gli strumenti, le piccole cassette di tessuto congelato e mandrino montaggio. </li><li> Recupera tessuto prostatico congelato da crioconservazione e posto in una schiuma secchio pieno di ghiaccio secco per il trasporto. Collocare il tessuto in criostato equilibrare al criostato temperatura per almeno 30 minuti. Nota: tessuti della prostata umane per laser-capture micro-dissezione possono essere sia fresco congelato o fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE). I vincoli di tempo e preparazione del vetrino sono leggermente diverse tra le fonti di tessuto. Qui si descrivono i passaggi per sezioni congelate. </li><li> Lavorare con un tessuto alla volta, e schizzare mezzo di montaggio congelato nel bottom della cassetta e rapidamente montare il tessuto prostatico congelato nel mezzo di montaggio congelati utilizzando le pinze refrigerati. </li><li> Posizionare la cassetta con il tessuto sul refrigeratore in criostato per 5 minuti per impostare montante congelato. </li><li> Bagnate una piccola quantità di mezzo di montaggio congelato sul mandrino e premere delicatamente il tessuto montato lato basso verso l&#39;alto sul montante congelato. Let impostato nel criostato per 5 minuti per consentire la soluzione di montaggio congelato solidificare completamente. </li><li> Posizionare mandrino nel supporto e stringere. </li><li> Bloccare la maniglia in posizione di blocco e posizionare una nuova lama sul criostato. Per gli endpoint molecolari downstream che comprendono una fase di amplificazione (cioè, qPCR) è consigliabile utilizzare una nuova lama per ogni paziente per prevenire la contaminazione (o spostare la lama verso utilizzare parte della lama per il campione successivo). </li><li> Sbloccare la maniglia e far avanzare con attenzione il tessuto a mano o con un pedale per uniformare ed esporre il tessuto con 50 μm sezioni fino all&#39;esposizione tessuto desiderato viene raggiunto. </li><li> Regolare criostato a 5 micron, tagliare una o due sezioni e metterli su vetrino addebitato per ematossilina eosina (H &amp; E) colorazione (vedi punto 2). </li><li> Porre immediatamente il vetrino al freddo 100% di etanolo per 2 min. </li><li> Rimuovere il vetrino caricato da etanolo e lasciare asciugare a temperatura ambiente prima di procedere alla colorazione H &amp; E (punto 2). </li><li> Posizionare RT PEN-frame di diapositive su un supporter telaio. </li><li> Regolare criostato a 10 micron e posizionare le sezioni sui vetrini telaio PEN RT. Da uno a quattro sezioni può essere posto su ciascun vetrino a seconda delle dimensioni del tessuto. </li><li> Immergere immediatamente il vetrino al freddo 100% di etanolo per 2 min. </li><li> Rimuovere i vetrini PEN-telaio da etanolo e conservare il vetrino in una scatola di diapositive in una scatola in un essiccatore -80 ° C freezer fino al momento LCM. Tre giorni è il tempo massimo di conservazione per il recupero ottimale RNA. </li><li> Procedere con la fase 2 per solo il vetro carica scivolòe. Procedere con il passaggio 3 per PEN-telai per diapositive. </li></ol> 2. ematossilina e eosina-Y (H &amp; E) Stain per istologico Mark-up Nota: Questo se per il tessuto sul vetrino carica e NON la slitta PEN-cornice per LCM. <ol><li> Idratare le sezioni sul vetrino carica immergendo il vetrino attraverso etanolo classificato come segue: immergerlo due volte in 100% di etanolo per 3 min, due volte in 95% di etanolo per 3 min, una volta in 70% di etanolo per 3 min e due volte in acqua distillata H 2 O per 3 min. <ol><li> Preparare la soluzione alcolica acida: 99 ml di etanolo al 70% + 1 ml 1% e 0,1% di HCl soluzione di bicarbonato di sodio: 0,1 g di bicarbonato di sodio in 100 ml di acqua distillata H 2 O </li></ol></li><li> Immergere il vetrino in ematossilina Gill II (0,4%) per 5 min. </li><li> Lavare eccesso macchia in costante rubinetto aperto H 2 O per 3 min. </li><li> Immergere il vetrino 10 volte in alcol acido </li><li> Lavare il vetrino in esecuzione rubinetto H 2 O per 3 min. </li><li> Immergere il vetrinonello 0,1% soluzione di bicarbonato di sodio per 30-60 secondi per accendere il colore violaceo a blu. </li><li> Lavare il vetrino in esecuzione rubinetto H 2 O per 3 min. </li><li> Sciacquare il vetrino in etanolo al 95% con 10 tuffi. </li><li> Immergere il vetrino in tempi eosina-Y 2-3 per 15 sec totale. </li><li> Disidratare il vetrino attraverso etanolo classificato come segue: immergere il vetrino due volte in etanolo al 95%, due volte in 100% di etanolo, e due volte a xilene (assicurarsi che il tessuto appare chiaro che indica la disidratazione completa). </li><li> Montare la slitta con non acquoso dura mezzo di montaggio e copertura di slittamento permanente. </li><li> Lasciare asciugare il vetrino per 30 min. </li><li> Diapositiva scansione con qualsiasi scanner intera diapositiva e stampare una grande, un&#39;immagine ad alta risoluzione su 8 &quot;x 11&quot;. </li><li> Outline aree di interesse (in genere fatto da un consiglio di anatomopatologo certificata) con un pennarello. Questa marcatura è la guida per la procedura di LCM. </li></ol> 3. Toluidine Blu colorazione dei vetrini PEN-telaio Nota: Thsi è fatto lo stesso giorno il LCM. Utilizzare depcH 2 O acqua per tutte le soluzioni. Completare tutti i passaggi zona di libero RNasi. Tutti coplins devono essere puliti con la soluzione RNase-decontaminazione. <ol><li> Il giorno della LCM rimuovere i vetrini PEN-frame da -80 ° C freezer e idratare da diapositive immersione delicatamente nel 90% EtOH per 2 minuti poi il 75% EtOH per 2 min. <ol><li> Preparare 0,5% toluidina blu sciogliendo in acqua per biologia molecolare, quindi filtrare sterilizzare attraverso un filtro 0,2 micron e conservare a temperatura ambiente. Questa soluzione può essere riutilizzato per un massimo di 6 mesi. Nota: E &#39;altamente consigliato di preparare la soluzione prima come la filtrazione può prendere un paio di ore. </li></ol></li><li> Colorare il tessuto prostatico mediante immersione delicatamente diapositive in 0,5% toluidina blu per 5-30 secondi. Decolorare il tessuto mediante lavaggio vetrini 2 volte in depcH 2 O per 15 secondi seguiti da 75% EtOH per 30 sec a 3 min. Nota: macchia e Decolorare tempi possono essere regolati per garantire una buona colorazione. Prostata tende a oltre macchia. </li><li&gt; trasferimento diapositive PEN-struttura di riparo RNAase-gratuito su ghiaccio. </li></ol> 4. laser-capture Micro-dissezione (LCM) <ol><li> Immediatamente prima LCM, scivolo secco su un vetrino più caldo a 42 ° C per 15 min. Secco solo la diapositiva che verrà elaborato e memorizzare il resto sul ghiaccio fino al momento per loro. </li><li> Accendere LCM e computer in questo ordine, di alimentazione del microscopio, la chiave laser, l&#39;interruttore laser e quindi il computer. Avviare il software Microdissezione laser. </li><li> Utilizzare il software per controllare il microscopio per caricare le diapositive e tubi di raccolta. Clicca su &quot;supporto del campione scaricare&quot;, caricare la slitta con le sezioni sul supporto vetrino da microscopio con il tessuto rivolto verso il basso e inserire il supporto diapositive nello slot appropriato al microscopio, quindi fare clic su &quot;continua&quot;. <ol><li> Clicca su &quot;tubi di raccolta scarico&quot;, etichetta e caricare 0,5 ml provette sul supporto tubo e inserirla nello slot appropriato nello strumento. Una voltatappi sono garantiti, aggiungere 35 ml di tampone Lysis per i tappi di raccolta e cercare di evitare le bolle. Quindi fare clic su &quot;OK&quot;. Nota: se l&#39;evaporazione è un problema, diluire il tampone come segue: tampone di lisi 25 microlitri con 10 microlitri depcH2O. </li></ol></li><li> Nel software, selezionare la posizione in cui la diapositiva è stata posta nel portavetrini. Selezionare il cappuccio di raccolta per raccogliere il campione LCM. </li><li> Visualizza e mettere a fuoco la slitta attraverso il computer a 10X. Utilizzare il software per calibrare il laser selezionando &quot;Laser&quot; e poi &quot;calibrare&quot;. Regolare la potenza, apertura e la velocità del laser, selezionando &quot;laser&quot; poi &quot;controllo&quot; per consentire il raggio laser per tagliare l&#39;area selezionata completo ed efficiente. Ripetere le regolazioni fino tagli laser completamente attraverso il tessuto. </li><li> Utilizzando il mark-up 8 &quot;x 11&quot; patologo come guida, utilizzare lo strumento &quot;disegnare forma&quot; circoscrivere le aree desiderate di epithelium nella vista ed evitare la raccolta di qualsiasi stroma. Nota: le aree multipli possono essere selezionati all&#39;interno di un punto di vista, ma non si spostano in un altro senza prima vista taglio facendo clic sullo strumento &quot;taglio forma&quot;. <ol><li> Se un&#39;area non viene completamente tagliato dal laser utilizzare lo strumento &quot;circolare e di taglio&quot; di andare oltre manualmente. Continua spostando l&#39;obiettivo di nuove viste e ripetere taglio laser fino slitta è completamente sezionato o la quantità desiderata di tessuto è stato raccolto (tipicamente 100 ghiandole benigne resa 150-500 ng di RNA). (vedi esempio in figura 1A). </li></ol></li><li> Rimuovere con attenzione i tubi dal titolare di raccolta e chiudere i tappi, memori del tampone di lisi e del tessuto nelle calotte. Brevemente centrifugare per 30 sec per raccogliere liquidi e tessuto del fondo della provetta. Incubare i campioni a 42 ° C per 30 min e conservare a -80 ° C fino al momento per l&#39;isolamento dell&#39;RNA. </li></ol> 5. totale isolamento di RNA con un FilKit base ter-e analisi di qualità <ol><li> Scongelare le provette su ghiaccio e portare il volume della soluzione a 100 microlitri. </li><li> Pre-bagnare il micro filtro di un kit di isolamento dell&#39;RNA applicando 30 microlitri ofLysis Soluzione al centro del filtro e lasciare in ammollo whileperforming le due fasi successive (almeno 5 minuti). </li><li> Aggiungere 3 ml di soluzione di LCM Additivo (fornito nel kit) al lisato e mescolare nel vortex per 5 secondi. Centrifugare per 30 secondi per raccogliere il liquido sul fondo della provetta. </li><li> Centrifugare il filtro di pre-bagnato per ~ 30 secondi alla massima velocità per rimuovere il liquido. </li><li> Aggiungere 1,25 volumi (in questo caso 129 ml) di 100% di etanolo alla miscela lisato, delicatamente vortice o pipetta su e giù. ** Questo metodo recuperare entrambe le specie di RNA grandi e piccoli. </li><li> Caricare il campione sul microfiltro pre-umidificati, e centrifugare a 10.000 xg per 1 min per legare l&#39;RNA al filtro. Quindi lavare micro filtro con 180 ml di &quot;soluzione di lavaggio 1, R21; centrifugare a 10.000 xg per 1 min. Nota: Da questo punto in tutte le centrifugazioni dovrebbe essere fatto a 13.000 xg, o la velocità massima. </li><li> Lavare Filtro due volte con 180 ml di &quot;soluzioni di lavaggio 2 e 3&quot;, rispettivamente come indicato dal protocollo del kit. Centrifugare per 30 secondi, poi scarta il flusso attraverso, e girare il filtro per 1 min per rimuovere il liquido residuo e asciugare il filtro. </li><li> Trasferire filtro per un nuovo tubo di raccolta. </li><li> Soluzione calda eluizione a -95 ° C (fornito con il kit). </li><li> Applicare 10 ml di soluzione di eluizione preriscaldato al centro del filtro, chiudere il tappo e conservare per 5 minuti a RT. Poi centrifugare per 1 minuto per eluire l&#39;RNA, e ripetere questo passaggio una volta a cedere ~ 20 ml di RNA. </li><li> Eseguire il trattamento DNasi I per 15 minuti a 37 ° C. </li><li> Quantificare l&#39;RNA da spettrofotometro con assorbanza a 260 nm. Il rapporto di densità ottica a lunghezze d&#39;onda di 260 nm e 280 nm viene utilizzato per valutare la purezzal&#39;RNA (vedi Tabella 1) 15. </li></ol> 6. Analisi di espressione genica Nota: espressione genica delle specie di RNA lunghi (come mRNA e lncRNAs) è mostrato in Fase 6.1 e specie di RNA brevi (come microRNA) è mostrata in fase 6.2. Sono disponibili diversi kit per RT-qPCR e la quantità di RNA richiesta varia a seconda del kit (non più di 10 ng). RNA analisi di sequenziamento è descritto in 6.3. <ol><li> Trascrivere inversa (RT) l&#39;RNA in cDNA mescolare 5 ml di 20 ng / mL campione di RNA con 5 ml di master mix RT (tampone RT, dNTP di, primer casuali, RT enzima inibitore RNase). Incubare la reazione per 25 minuti a 25 ° C, poi 120 min a 37 ° C e 5 min a 85 ° C. </li><li> Diluire la reazione RT 1:10 con RNasi acqua gratuita e utilizzare 2,5 microlitri per 10 microlitri reazione qPCR con primer o set di primer / sonde per i geni di interesse. Nota: Per facilitare l&#39;analisi di RNA parzialmente degradati Si consiglia di utilizzare primer for ampliconi più brevi (meno di 100 bp) 16. (Tabella 2B) <ol><li> Per l&#39;analisi di espressione dei microRNA eseguire reazione RT mescolando 5 ml di 2-10 ng / mL campione di RNA con 5 ml di master mix RT. Nota: ogni tecnologia di rilevamento microRNA disponibile in commercio a base di PCR richiede l&#39;uso di primer RT proprietari e specifici. </li></ol></li><li> In alternativa o in aggiunta a RT-PCR, utilizzare generazione sequenziamento successivo (RNA-seq o piccolo-RNA-seq) per quantificare diverse specie di RNA. Tipicamente, usare 500 ng di RNA per questa procedura (Tabella 3) ed eseguire il metodo come indicato dallo strumento costruttore e rilevamento. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Profilo di espressione genica da campioni umani può essere impegnativo, non solo per la qualità o la quantità di tessuto a disposizione, ma anche per le diverse entità istologiche presenti in un dato campione di tessuto. Ciò è particolarmente impegnativo nella prostata in cui tessuti benigni sono in gran parte i tessuti stromali e le aree di cancro sono privi di stroma. LCM facilita separazione fisica di stroma prostatico e l&#39;epitelio RNA per una firma più accurata dei due diversi tipi di cellule (Figura 1A)...

La prostata è un tessuto eterogeneo composto da epitelio secernente disposti in acini ghiandolari circondato da stroma fibromuscolare composta principalmente da muscolatura liscia 1. Il vano epiteliale è composto da cinque diversi tipi di cellule, ma organizzati: cellule basali, cellule, cellule neuroendocrine secretoria, cellule amplificazione di transito e cellule staminali 2. Nel cancro della prostata (APC), che deriva dalle cellule epiteliali luminali, la crescita del adenocarcinoma provoca un evidente declino progressivo del vano stromale 3. Per queste ragioni, campioni di tessuto saranno chiare differenze nella proporzione di stromali e cellule epiteliali tipo basato sulla misura dei PCA. Queste differenze possono portare a ipotesi di parte dei dati di espressione genica acquisiti dai tessuti interi senza riguardo per microdissezione del tipo cellulare desiderato. Pertanto, per eliminare questa tendenza è indispensabile separare tipi cellulari prima dell&#39;estrazione dell&#39;RNA eanalisi di espressione genica. Macrodissection o microdissezione possono essere utilizzati per separare fisicamente aree epiteliali ben caratterizzati dallo stroma circostante 4 -6. Macrodissection è tipicamente fatto con una lama di rasoio sotto un microscopio da dissezione e funziona bene per separare grande PCa noduli da stroma, ma non è in grado di rimuovere dell&#39;epitelio benigna da stroma circostante (vedi esempio di iperplasia prostatica istologia in figura 1). Microdissezione con un laser (LCM) è significativamente più manodopera rispetto macrodissection, ma può sezionare molto preciso epitelio benigna 4. Pubblicazioni recenti del nostro laboratorio hanno dimostrato che l&#39;RNA può essere estratto con successo da LCM da entrambi inclusi in paraffina (FFPE) biopsie fissati in formalina o tessuti congelati 4,7-9. Le principali sfide a estrazione LCM-RNA sono 1) a sezionare con precisione le aree desiderate del tessuto, e 2) per preservare RIntegrità NA durante il 4,10 LCM e isolamento del processo. RNA isolato da popolazioni cellulari pure può essere utilizzato per l&#39;analisi di espressione genica in diversi modi tra cui trascrizione inversa PCR quantitativa (RT-qPCR) 7,8, microarray 11, e profondo -sequencing 12-14. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di isolare RNA totale da LCM prostatico epitelio dal tessuto congelato per le analisi di espressione genica a valle.

<table><tbody><tr><td>RNasi-VIA&nbsp;</td><td>MBP</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>PEN-membrana 4,0 mm vetrini&nbsp;</td><td>Leica</td><td>11600289</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini in vetro, Superfrost Plus</td><td>FisherBrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 200 proof</td><td>Decon labs.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>DEPC (pirocarbonato di dietile)</td><td>Sigma</td><td>D-5758</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Coplins (barattolo di colorazione)</td><td>IHCWORLD</td><td>M900-12</td><td></td></tr><tr><td>Coplins (rack di colorazione)</td><td>IHCWORLD</td><td>M905-12</td><td></td></tr><tr><td>Aperio ScanScope</td><td>Aperio (Leica)</td><td>ScanScope&reg; </td><td></td>CS</tr><tr><td>Toluidina Blu</td><td>Fluka</td><td>89640-5G</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di Microdissezione Laser</td><td>Leica</td><td>LMD7000</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Provette a parete sottile per LCM</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0350</td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous&reg;-Micro Kit di isolamento dell'RNA totale</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td>Thermo Fisher Scientific Marca</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>Fluorimetro ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Life</td><td>Technologies</td><td>Q32866</td> Kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacità <td>del marchio Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td></td><td>Biosystems Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td>Thermo Fisher Scientific Brand</td></tr><tr><td>Kit di sintesi universale del cDNA II, 8-64 rxns</td><td>Exiqon</td><td>203301</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan microRNA RT kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366597</td><td>Thermo Fisher Scientific Marca</td></tr><tr><td>Ematossilina colorante&nbsp;</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3536-16</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Y</td><td>Richard Allan Scientific&nbsp;</td><td>Codice: 7111</td><td></td></tr></tbody></table>

laser-capture microdissezione di human prostatica epitelio per l&#39;analisi di rna

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

La ghiandola prostatica contiene un ambiente eterogeneo di tipi di cellule stromali, epiteliali, neuroendocrine e immunitarie. La prostata sana è composta da stroma fibromuscolare che circonda i lumi secretori discreti rivestiti di epitelio e una popolazione molto piccola di cellule immunitarie e neuroendocrine. Al contrario, le aree di cancro alla prostata hanno un aumento dell'epitelio luminale displastico con una popolazione stromale notevolmente ridotta o assente. Data la profonda differenza tra i tipi di cellule stromali ed epiteliali, è imperativo separare i tipi di cellule per qualsiasi tipo di analisi molecolare a valle. Nonostante questa conoscenza, la maggior parte degli studi sull'espressione genica confronta la prostata benigna con il cancro senza micro-dissezione, portando a bias stromale nei campioni benigni. La microdissezione a cattura laser (LCM) è un metodo efficace per separare fisicamente diversi tipi di cellule da una sezione di campione. L'obiettivo di questo protocollo è dimostrare che l'RNA può essere isolato con successo dall'epitelio prostatico umano raccolto con LCM e utilizzato per studi di espressione genica a valle come RT-qPCR e RNAseq.

In un precedente studio abbiamo dimostrato l&#39;uso di LCM per raccogliere tessuti epiteliali e stromali confrontare profilo di espressione mediante RT-qPCR di mRNA e microRNA dai tessuti prostatici congelati e FFPE dallo stesso paziente 4. LCM richiede molto tempo, specialmente se grandi quantità di RNA è da raccogliere per l&#39;analisi di sequenziamento di prossima generazione. Pertanto, è fondamentale per mantenere lo spazio di lavoro e strumenti RNase. Si raccomanda di controllare la qualità e cellula-s...

L'obiettivo di questo protocollo è utilizzare la micro-dissezione a cattura laser come metodo efficace per isolare popolazioni pure di tipi cellulari da tessuti prostatici eterogenei per l'analisi dell'RNA a valle.

Laser-capture Microdissezione di Human prostatica Epitelio per l&#39;analisi di RNA

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

L'obiettivo generale di questo protocollo di microdissezione con cattura laser è isolare l'RNA totale da popolazioni purificate di tipi cellulari epiteliali prostatici ottenute da tessuti prostatici congelati eterogenei, per analisi successive dell'espressione genica. Questo metodo può aiutare ad analizzare campioni di pazienti e rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sul cancro alla prostata, come ad esempio in che modo l'espressione dell'RNA differisce tra campioni di tessuto epiteliale benigno e patologico, oppure tra campioni provenienti da studi clinici. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la microdissezione con cattura laser consente l'isolamento di RNA da popolazioni omogenee di cellule epiteliali o stromali a partire da tessuto prostatico congelato.Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà nell'ottenere RNA di alta qualità perché non sanno quali passaggi siano critici per mantenere gli RNA. Condizioni libere Iniziare raccogliendo tutti i reagenti e gli strumenti necessari per la procedura. Dopo aver lasciato equilibrare il tessuto prostatico congelato all'interno del criostato per 30 minuti, versare del mezzo di m

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Quantitativa reale tempo di reazione a catena della polimerasi (qPCR) è un metodo rapido e sensibile per indagare i livelli di espressione di microRNA (miRNA vari) molecole in campioni tumorali. Usando questo metodo di espressione di centinaia di molecole diverse miRNA possono essere amplificati, quantificati e analizzati utilizzando lo stesso modello cDNA.

Rilevamento MicroRNA in tumori della prostata dal Quantitative Real-time PCR (qPCR)

Retrovirus endogeni umani (HERV), che occupano l'8% del genoma umano, mantengono la capacità di codifica scarse, ma centinaia di migliaia di lunga ripetizioni terminali (litri). Un microarray Affymetrix personalizzato è stato progettato per identificare l'espressione individuale HERV locus ed è stato utilizzato su tessuti di carcinoma della prostata come un proof of concept per i futuri studi clinici.

Microarray identificazione dei singoli HERV Loci Expression: Domanda di Biomarker Discovery in Cancro alla prostata

Analisi dell'espressione genica di un sottogruppo di cellule in un tessuto specifico rappresenta una grande sfida. In questo articolo si descrive come isolare RNA totale di alta qualità da una popolazione di cellule specifiche, combinando un metodo immunomarcatura rapida con microdissezione laser.

RNA isolamento da cellulari sottopopolazioni specifiche utilizzando laser-capture Microdissection combinazione con Rapid immunomarcatura

Qui descriviamo un protocollo semplificato per l'analisi dell'espressione di microRNA (miRNA) in tessuti clinici archiviati Fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) o in tessuti clinici freschi congelati per il cancro alla prostata (PCa) che impiegano la PCR quantitativa in tempo reale (RT-PCR) e l'ibridazione in situ (ISH).

Analisi miRNA nel tumore alla prostata tessuti cliniche

Qui, descriviamo un protocollo per una microdissezione laser riproducibile (LCM) per isolare il trabecolato (TM) per analisi di RNA a valle. La capacità di analizzare i cambiamenti nell'espressione genica nella TM vi aiuterà a comprendere i meccanismi molecolari delle malattie oculari correlate a TM.

Microdissezione laser di elevata purezza trabecolato dai Mouse occhi per analisi dell'espressione genica

L'obiettivo del presente protocollo è quello di ottenere campioni di RNA ad alta integrità dai gangli enterici isolati dal tessuto intestinale umano non fissato, appena resecato mediante microdissezione laser (LCM). Questo protocollo prevede preparazione flash-congelati campioni di tessuto intestinale umano, cryosectioning, colorazione etanolica e disidratazione, LCM e l'estrazione di RNA.

Ottimizzazione di Laser Capture Microdissection per l'isolamento dei gangli enterici dal tessuto umano fresco congelato

È stato sviluppato un protocollo di microdissezione di cattura laser (LCM) per ottenere una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per l'analisi dell'espressione genica nelle cellule ossee. L'attuale studio si concentra sulle sezioni del femore del topo. Tuttavia, il protocollo LCM riportato qui può essere utilizzato per studiare l'espressione genica nelle cellule di qualsiasi tessuto duro.

Un protocollo di microdissezione di cattura laser che produce RNA di alta qualità da ossa di mouse fresh-congelate

Questo protocollo descrive la microdissezione di cattura laser per l'isolamento della cartilagine e dell'osso da sezioni fresche congelate dell'embrione di topo. La cartilagine e l'osso possono essere rapidamente visualizzate mediante colorazione viola cresilio e raccolte proprio per produrre RNA di alta qualità per l'analisi trascrittomica.

Microdissezione laser di cattura della cartilagine embrionale del topo e dell'osso per l'analisi dell'espressione genica

La resistenza alla terapia si sviluppa spesso in pazienti con carcinoma della prostata avanzato e, in alcuni casi, il cancro progredisce verso un sottotipo letale chiamato cancro alla prostata neuroendocrino. Valutare i piccoli cambiamenti molecolari mediati dall'RNA non codificanti che facilitano questa transizione consentirebbe una migliore stratificazione della malattia e l'identificazione di meccanismi causali che portano allo sviluppo del cancro alla prostata neuroendocrino.

Sequenziamento di piccoli RNA non codificanti da tessuti fissati in formalina ed esosomi derivati dal siero da pazienti affetti da cancro alla prostata resistenti alla castrazione

Descriviamo un protocollo per la microdisezione laser di sottosezioni del rene umano, tra cui il glomerulus, il tubulo prossimale, l'arto ascendente spesso, il condotto di raccolta e l'interstizio. L'RNA viene quindi isolato dai compartimenti ottenuti e il sequenziamento dell'RNA viene effettuato per determinare i cambiamenti nella firma trascrittamica all'interno di ogni sottoseme.

Applicazione della microdisezione laser per scoprire la trascritomica regionale nel tessuto renale umano

Questo protocollo descrive un metodo per isolare l'RNA da regioni istologiche definite di tessuto epatico di topo inserito nel composto di paraformaldeide e composto Optimal Cutting Temperature, utilizzando microdissezione a cattura laser, consentendo un'analisi mirata dell'espressione genica a valle.

Microdissezione da cattura laser del tessuto epatico di topo fissato con paraformaldeide per l'analisi dell'RNA

Impara la microdissezione laser-capture per isolare RNA da popolazioni pure di epitelio prostatico in campioni congelati eterogenei. Questo metodo supporta l'analisi dell'espressione genica nella ricerca sul cancro della prostata.

Laser-capture Microdissezione di Human prostatica Epitelio per l'analisi di RNA

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