Laser-capture Microdissezione di Human prostatica Epitelio per l'analisi di RNA

L'obiettivo generale di questo protocollo di microdissezione a cattura laser è isolare l'RNA totale da popolazioni pure di tipi di cellule epiteliali prostatiche da tessuti prostatici congelati eterogenei per l'analisi dell'espressione genica a valle. Questo metodo può aiutare ad analizzare i campioni dei pazienti e rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sul cancro alla prostata, come ad esempio il modo in cui l'espressione dell'RNA differisce nei campioni di tessuto protesico epiteliale benigno e di malattia o nei campioni di studi clinici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la micro dissezione a cattura laser consente l'isolamento dell'RNA di popolazioni omogenee di cellule epiteliali o str dal tessuto prostatico congelato.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo faranno fatica ad acquisire RNA di alta qualità perché non sanno quali passaggi sono fondamentali per mantenere gli RNA. Condizioni libere Iniziare raccogliendo tutti i reagenti e gli strumenti necessari per la procedura. Dopo aver lasciato che il tessuto prostatico congelato si equilibrasse all'interno del criostato per 30 minuti, spruzzare il mezzo di montaggio sul fondo della cassetta e montare rapidamente il tessuto utilizzando una pinza refrigerata.

Posizionare la cassetta nel refrigeratore del criostato per cinque minuti per impostare il mezzo di montaggio. Una volta indurito, spruzzare il terreno di montaggio congelato sul mandrino e premere con cura il fazzoletto montato al suo interno. Lato inferiore rivolto verso l'alto.

Lasciare riposare la preparazione per cinque minuti. Prima di posizionare il mandrino nel supporto, bloccare l'impugnatura in posizione e inserire una nuova lama sul criostato. Dopo aver sbloccato l'impugnatura, far avanzare con cautela il campione fino a raggiungere l'esposizione tissutale desiderata.

Quando è pronto, regolare il criostato a cinque micron e tagliare una o due sezioni. Posizionare queste sezioni su un vetrino caricato per la colorazione con ematina ed eoina. Posizionare immediatamente il vetrino in etanolo freddo al 100% per due minuti.

Trascorso questo tempo, rimuovere il vetrino e lasciarlo asciugare a temperatura ambiente. Il vetrino colorato h e d fornisce una migliore visualizzazione delle trame nucleari e deve essere utilizzato dal patologo per marcare le aree di interesse. Quindi, posiziona un portapenna a temperatura ambiente.

Far scorrere in un supporto del telaio, regolare il criostato a 10 micron e creare sezioni. Su ogni vetrino possono essere posizionate da una a quattro sezioni, a seconda delle dimensioni del tessuto. Immergere immediatamente il vetrino in etanolo freddo al 100%.

Rimuovere il vetrino dopo due minuti e conservarlo nel congelatore per un'analisi successiva. Lo stesso giorno della microdissezione a cattura laser, recuperare i vetrini del telaio della penna dal congelatore lavorando in un'area priva di RNA. Idratare i vetrini immergendoli delicatamente in etanolo al 90% per due minuti, quindi in etanolo al 75% per due minuti.

Una volta idratato, colorare il tessuto prostatico immergendo delicatamente i vetrini in blu toine allo 0,5% per un periodo compreso tra cinque e 30 secondi. Trattenere il tessuto lavando due volte i vetrini in acqua profonda per 15 secondi, seguiti da etanolo al 75% per 30 secondi o tre minuti. Infine, trasferisci i vetrini della cornice della penna in un contenitore asciutto privo di RNA su ghiaccio.

Prima di iniziare la procedura, posizionare un vetrino ad asciugare su uno scaldavetrini per 15 minuti. Asciugare solo il vetrino che verrà lavorato e conservare il resto in ghiaccio fino al momento del bisogno. Accendere i componenti LCM nell'ordine seguente.

L'alimentazione del microscopio, la chiave laser, l'interruttore laser e poi il computer. Quindi, avvia il software di microdissezione laser utilizzando il software. Chiedere al microscopio di caricare i vetrini e le provette di raccolta.

Fare clic su scarica il supporto del campione e caricare il vetrino sul supporto del vetrino con il fazzoletto rivolto verso il basso. Inserire il supporto del vetrino nell'apposita fessura del microscopio e fare clic su continua. Quindi, fare clic su scaricare le provette di raccolta.

Etichettare e caricare le provette sul portaprovette e inserirle nell'apposita fessura. Chiudere i tappi e aggiungere 35 microlitri di tampone di lisi. Facendo attenzione a evitare bolle.

Una volta caricati i tappi di raccolta, fare clic su OK. Utilizzare il software per selezionare la posizione del vetrino nel supporto, quindi selezionare il tappo di raccolta per raccogliere il campione. Visualizza e metti a fuoco il vetrino attraverso il computer con un ingrandimento di 10x.

Utilizzare il software per calibrare il laser selezionando il laser. Quindi calibrare, regolare l'apertura di potenza e la velocità del laser selezionando il laser, quindi controllare. Continuare ad effettuare le regolazioni fino a quando il laser non taglia completamente il tessuto.

È fondamentale delineare le aree di interesse tipicamente eseguite da un patologo certificato al fine di sezionare accuratamente le aree di desiderio del tessuto sottoposto a LCM Utilizzando il markup di otto per 11 ore e il patologo come guida visiva. Usa lo strumento di disegno della forma nel software per circoscrivere le aree desiderate dell'epitelio nella vista ed evitare di raccogliere stroma. Fare clic su Taglia per avviare il laser.

Se un'area non è completamente tagliata, utilizzare lo strumento di spostamento e taglio per ripassarla manualmente. Continuare a spostare l'obiettivo su nuove viste e ripetere il taglio laser fino a quando il vetrino non è completamente sezionato o non è stata raccolta la quantità di tessuto desiderata. Al termine, rimuovere con cautela le provette dal supporto di raccolta e chiudere i tappi facendo attenzione alla lisi, al tampone e al tessuto nei tappi.

Brevemente, centrifugare per 30 secondi per raccogliere il liquido e il tessuto sul fondo della provetta. Incubare i campioni a 42 gradi Celsius per 30 minuti e conservarli a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'isolamento dell'RNA. Questi esempi mostrano sezioni rappresentative della prostata colorate con blu di toluidina su un vetrino con cornice di penna prima e dopo l'acquisizione laser di controlli specifici per tipo di cellule di epitelio benigno.

Confermare la specificità dell'area del tessuto catturata al laser. Epitelio benigno e stroma. Non esprimono il gene specifico del cancro alla prostata, A-M-A-C-R.

Lo stroma non esprimeva il gene specifico epiteliale e KX 3.1 durante il tentativo di questa procedura. È importante ricordare di lavorare in un ambiente privo di RNA per prevenire la degradazione dell'RNA. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare l'RNA da popolazioni omogenee di cellule epiteliali o tempesta da tessuto congelato per numerose tecniche di analisi a valle.

Non dimenticare che lavorare con un criostato può essere estremamente pericoloso in termini di precauzioni, come un buon allenamento e un'ottima attenzione alla lama dovrebbero essere sempre presi durante l'esecuzione di questa procedura.