Singola molecola microscopia a fluorescenza su Planar bilayers supportati

In questo video, mostreremo come preparare e caratterizzare il bilare lipidico supportato planare bio funzionalizzato. Descriveremo anche in dettaglio l'architettura di un microscopio a riflessione interna totale con capacità di rilevamento di singole molecole. Misureremo la densità del potere di eccitazione, la fluidità e la densità proteica del blay lipidico.

Cominciamo con la breve introduzione al blay lipidico planare supportato dal vetro. Quando piccole vescicole unilanari incontrano una superficie di vetro pulita, scoppiano e si allargano per formare un doppio strato lipidico contiguo. Su un cuscino d'acqua, in genere scegliamo il materiale del palmo.

L'ole fosfocolina o POPC ha il lipide predominante perché dà origine a doppi strati lipidici fluidi a temperatura ambiente e 37 gradi Celsius. Per la funzionalizzazione, aggiungiamo nichel antiossidante, un lipide sintetico con un gruppo di testa chelante del nichel, che lega le proteine tag della poliistamina. Ad esempio, la molecola co-stimolatoria B sette uno, la molecola di adesione, ICAM uno, e la molecola MHC caricata con peptidi marcati in fluorescenza per il riconoscimento delle cellule T come mostrato qui, tuttavia, questo sistema a doppio strato può in linea di principio essere impiegato per affrontare processi completamente diversi in una varietà di sistemi biologici.

A causa della natura del sistema planare, gli eventi di fluorescenza possono essere monitorati in modalità di riflessione interna totale, che riduce sostanzialmente lo sfondo cellulare ed è molto adatto per la microscopia a fluorescenza a singola molecola Per la preparazione dei lipidi, sono necessari i lipidi, il POPC e il cloroformio di nichel antiossidante e un pallone a fondo rotondo pulito per sciogliere i lipidi nel rapporto desiderato e il cloroformio e asciugarli sotto vuoto come mostrato qui. Dopo il trattamento in alto vuoto durante la notte, i lipidi formano una pellicola all'interno del pallone. Per la reidratazione dei lipidi, utilizzare Degas PBS a 10 millilitri di Degas PBS nella miscela lipidica essiccata.

Non mescolare. Ora, per evitare l'ossidazione dei lipidi, riempire il pallone con un gas inerte come azoto o argon, ruotare il pallone. I lipidi formano una sospensione lattiginosa.

Prelevare un piccolo campione come bianco per lo spettrofotometro per evitare lo scambio di gas durante la fase successiva. È molto importante sigillare correttamente il pallone contenente la sospensione lipidica. Utilizzare un nastro adesivo stabile al calore, ad esempio un nastro per autoclave in cui la protezione dell'aria durante la formazione fisica utilizza un bagno a ultrasuoni chiuso.

Dopo aver montato il pallone, avviare la procedura di sonicazione ad una potenza massima di 170 watt. Sonic Cade per 60 minuti. A causa della formazione fisica, la torbidità è diminuita in modo significativo.

Questo può essere verificato mediante spettrofotometria a 550 nanometri. Utilizzare l'aliquota presa prima della sonicazione come spazio vuoto. La densità ottica a 230 nanometri, che è indicativa della quantità lipidica, dovrebbe rimanere costante.

Qui riempiamo piccole provette per ultracentrifugazione con una sospensione visl da un millilitro e le posizioniamo in un rotore ad angolo fisso di un'ultracentrifuga da tavolo. È molto importante utilizzare solo piccole vescicole uni laina per la preparazione a doppio strato. Le vescicole multi laina più grandi e dense, che si formano anche durante la sonicazione, interferiscono con la fluidità del doppio strato e devono quindi essere pallidate e rimosse mediante centrifugazione.

Per prima cosa, centrifughiamo per un'ora a 150.000 g a temperatura ambiente. Il nat risultante viene quindi centrifugato per altre otto ore a 288.000 G a quattro gradi Celsius. Le luci di vetro devono essere molto pulite prima che le vescicole lipidiche possano diffondersi su di esse per formare un doppio strato contiguo e fluido.

Per questo, posizioniamo i vetrini di copertura in un tumulo di teflon, che poi mettiamo in un esercizio di recipiente di vetro. Grande attenzione dove la protezione degli occhi, i guanti protettivi e un camice da laboratorio e lavorare in un armadio chimico. Aggiungiamo una parte di perossido di idrogeno al 30% e poi tre parti di acido solforico concentrato per dare origine a acido perio monosolforico molto reattivo e ossidativo.

Questa miscela reagisce violentemente con le sostanze organiche, comprese quelle della pelle, degli occhi e dei vestiti. Si riscalda immediatamente. Incubare i vetrini per 30 minuti.

Afferrare il vetrino coprioggetti con la forza Lavare accuratamente l'acido su entrambi i lati del vetrino coprioggetto pulito utilizzando acqua distillata W o unificata di alta qualità. Quindi posizionare il vetrino su un supporto in teflon e lasciarlo asciugare per non più di 10 minuti per poter produrre più doppi strati lipidici individuali contemporaneamente. Incolliamo vetrini coprioggetti essiccati con indurimento rapido.

Colla epossidica bicomponente in una camera tecnica di laboratorio a otto o 16 pozzetti. Innanzitutto, rimuovere con cautela il vetrino originale lept dal suo telaio. Mescolare i due componenti della colla in un rapporto di uno a uno.

Distribuirlo uniformemente nelle scanalature inferiori del telaio della camera. Posizionare il vetrino coprinte pulito sul fondo coperto di colla del telaio della camera. Assicurarsi che la colla sia distribuita uniformemente tra il vetrino e il telaio di plastica.

Lascia indurire la colla per 30 minuti. Diluire la sospensione fisica lipidica in PBS da uno a 10 e filtrarla attraverso un filtro da 0,2 micron a 120 microlitri di questa diluizione in ciascun pozzetto di una camera a otto pozzetti o 60 microlitri in ciascun pozzetto di una camera a 16 pozzetti. Assicurati che l'intera superficie del vetro sia coperta e attendi 20 minuti.

Il doppio strato si è ora formato Per eliminare i residui les, sciacquare bene ogni pozzetto con 30 millilitri di PBS. Evitare ad ogni costo l'esposizione all'aria della superficie del vetro. Questo distruggerebbe istantaneamente il doppio strato per garantire che ogni pozzetto contenga lo stesso volume di tampone Per la successiva fase di decorazione delle proteine, riempire completamente ogni pozzetto e rimuovere la cupola del liquido.

Estrarre 330 microlitri. Questo lascerà circa 350 microlitri all'interno di ciascuno. Bene, per decorare il doppio strato con le proteine, prepara un master mix contenente proteine tecnologiche poliistaminiche a scelta e aggiungine 50 microlitri a ciascun pozzetto.

Le proteine si legano al gruppo anti-testa di nichel del lipide scuro per garantire risultati riproducibili: miscelate accuratamente ma con attenzione e incubano sempre per 60 minuti per rimuovere le proteine non legate. Lavare nuovamente con 30 millilitri di PBS. Concentriamoci ora sull'hardware per microscopia.

In primo luogo, illustreremo i requisiti della microscopia a riflessione interna totale per la microscopia del tappeto erboso basata su obiettivi. È necessario un obiettivo ad immersione in olio con un'elevata apertura numerica. Il fascio di eccitazione laser in entrata viene riflesso dallo specchio dicroico e focalizzato tramite una serie di due o tre lenti solo sul piano focale posteriore dell'obiettivo.

Quindi la luce laser guida l'obiettivo come un raggio rivestito lungo l'asse ottico. In questo modo, il campione fluorescente viene illuminato in tutta la sua profondità. Quando si trasloca il raggio perpendicolarmente all'asse ottico, il raggio rimane fascicolato, ma lascia l'obiettivo inclinato.

Se si continua a traslocare, si raggiungerà ad un certo punto l'angolo critico al quale il raggio viene totalmente riflesso all'interfaccia tra il vetrino coprioggetto e il campione. L'intensità dell'onda evanescente risultante decade in modo esponenziale e solo i quattro piani, che si trovano nelle immediate vicinanze dell'interfaccia fino a diverse centinaia di nanometri, vengono eccitati. Ora, illustriamo come focalizzare manualmente il raggio laser nel piano focale posteriore dell'obiettivo.

Utilizzando tre o due lenti con le prime due lenti, il diametro del raggio laser viene aumentato. Il rapporto tra la loro lunghezza focale determina la dimensione del punto di illuminazione sul piano del campione. Per garantire che il raggio rimanga fascicolato, regolare la distanza tra queste lenti in modo che sia uguale alla somma di entrambe le lunghezze focali.

La terza lente viene utilizzata per focalizzare il fascio di allargamento nel piano focale posteriore dell'obiettivo. Poiché la lunghezza focale di questa lente deve adattarsi alle dimensioni del corpo del microscopio e a quelle di un periscopio associato, nel nostro caso deve essere molto più lunga, con una variazione di 75 centimetri. La distanza tra la lente due e tre non ha alcuna influenza sulle proprietà del raggio.

Pertanto, lo spazio infinito intermedio può essere utilizzato per modificare il raggio in modo definito senza distorsioni. Ad esempio, è possibile inserire un'apertura e proiettare con precisione sul piano del campione. In sostanza, puoi ottenere lo stesso con l'uso di due lenti invece di tre.

Il sistema a due lenti è meno definito ma introduce meno aberrazioni delle lenti. Funzioni semplici come un'apertura possono ancora essere implementate molto bene per la modulazione temporale. Un laser a gas, a ferro o a stato solido deve essere posizionato davanti a un otturatore a impulsi, ad esempio un otturatore meccanico o un modulatore ottico al .

Una buona alternativa è un laser a diodi, che può essere modulato elettronicamente e non necessita di chiusura esterna. Due specchi sono sufficienti per puntare il raggio in qualsiasi luogo e in qualsiasi direzione. Come discusso in precedenza, le due lenti vengono utilizzate per allargare il fascio e per focalizzarlo sul piano focale posteriore del microscopio. Obiettivo.

Possiamo traslocare il raggio per la configurazione del tappeto erboso spostando lo specchio inferiore del periscopio su una guida ottica. Per il rilevamento delle immagini, utilizziamo una fotocamera altamente sensibile. Ad esempio, un dispositivo ad accoppiamento di carica moltiplicatrice di elettroni o un secondo raggio laser EM CCDA di una lunghezza d'onda diversa possono essere allineati nel percorso del fascio.

Con l'utilizzo di specchi e una sovrapposizione dicroica. Per il rilevamento simultaneo di due colori, posizioniamo un dispositivo di suddivisione del fascio disponibile in commercio nel percorso di emissione. Per gli esperimenti, è molto utile avere due percorsi del fascio di eccitazione indipendenti.

Ad esempio, uno per l'imaging del tappeto erboso e un secondo per il fotosbiancamento o l'attivazione mirati. Ciò può essere facilmente ottenuto implementando un set di 2 50 50 beam splitter. Come mostrato nella nostra illustrazione, due diversi sistemi di regolazione dell'obiettivo e dello specchio daranno origine a due profili di emissione e angoli di emissione individuali.

Ad esempio, uno allargato per l'imaging in erba e uno più focalizzato per lo sbiancamento o l'attivazione in non tappeto erboso. Un'apertura può essere posizionata nella trave non erbosa per modellare con precisione il punto di sbiancamento o attivazione. Due otturatori aggiuntivi, uno per ogni percorso del raggio, consentono un interruttore di controllo indipendente sul raggio laser, lasciando l'obiettivo in un percorso rettilineo non inclinato.

Accendere il misuratore di potenza e regolarlo sulla lunghezza d'onda del laser corrispondente. Misurare la potenza della luce laser sull'obiettivo e annotarla. Ora, traslocare lo specchio dietro il microscopio per inclinare il raggio laser verso l'obiettivo nella posizione del tappeto erboso.

Non guardare mai direttamente la luce laser. Nell'angolo in basso a destra, si vede il profilo di intensità del laser di eccitazione visualizzato attraverso l'emissione di un doppio strato decorato con proteine fluorescenti. Qui usiamo una rappresentazione di falsi colori per evidenziare regioni di diversa intensità.

Misura l'intensità media dello sfondo all'interno di una regione di interesse sufficientemente ampia. Questo valore dipende da impostazioni specifiche della fotocamera, come il guadagno EM e la velocità di lettura, e deve essere sottratto da tutte le intensità misurate. Determinare l'intensità media all'interno dell'intera area illuminata.

Scegliere il diametro abbastanza grande in modo che i valori di intensità alla periferia siano simili a quelli dello sfondo della telecamera, misurare l'intensità media dell'area centrale. Quest'area definisce la regione di interesse in cui verranno eseguiti successivamente gli esperimenti di microscopia. Ora, sottrai il valore medio dell'intensità di fondo dalle intensità sia dell'area eliminata che di quella centrale.

Quindi, moltiplica le intensità corrette per lo sfondo con il numero di pixel corrispondente della dimensione della regione per arrivare alle intensità integrate. Imposta l'intensità integrata dell'area illuminata su uno e calcola la frazione per l'area centrale. La potenza misurata con il misuratore di potenza.

Nel nostro caso, cinque milliwatt sono direttamente proporzionali all'intensità integrata dell'intera area illuminata. Moltiplicare questo valore per la frazione di potenza dell'area centrale per determinare la potenza all'interno dell'area centrale. Nel nostro esempio, 1,15 milliwatt, il fattore per convertire il numero di pixel in micron quadrati dipende dalla dimensione effettiva dei pixel del chip della fotocamera e dall'ingrandimento del percorso di emissione.

Può essere facilmente determinato con un vetrino micrometrico. Nel nostro esempio, l'area centrale corrisponde a 170,8 micron quadrati. La densità di potenza si riferisce alla potenza misurata divisa per l'area e quindi equivale a 1,15 milliwatt diviso per 170,8 micron quadrati o 0,007 milliwatt per micron quadrato.

Questo è 0,7 kilowatt per centimetro quadrato. Per determinare la fluidità del doppio strato, eseguiamo un recupero della fluorescenza dopo l'esperimento di fotosbiancamento dell'involucro. Come mostrato nel filmato in basso a sinistra, immaginiamo il doppio strato fluorescente a bassa densità di potenza.

Nel filmato in basso a destra, è possibile vedere la camera tecnica di laboratorio corrispondente sul microscopio. Quindi sbiancamo un'area circolare con i brevi impulsi ad alta densità di potenza e monitoriamo il recupero a bassa densità di potenza. Ancora una volta, il montaggio fornisce una panoramica dell'esperimento per diversi punti temporali con il tempo zero come impulsi di candeggina.

Quantifichiamo l'intensità media della fluorescenza corretta per il fondo all'interno del cerchio di marcatura e normalizziamo tutte le intensità misurate all'intensità all'inizio dell'esperimento. Prima degli impulsi di candeggina, tracciamo i valori di intensità normalizzati rispetto al tempo. Il valore di saturazione rappresenta la frazione mobile nel nostro caso oltre il 90%Innanzitutto, scatta un'immagine del doppio strato a bassa densità di potenza di eccitazione.

Ad esempio, posizionando un filtro a densità ottica con un valore di attenuazione logaritmica di due, questo riduce la potenza di un fattore di 100. Il tempo di esposizione deve essere costante durante l'intera procedura e sufficiente per visualizzare la singola forza del fluido alla densità di potenza non attenuata nel nostro caso, 10 millisecondi a 0,7 kilowatt per centimetro quadrato. Utilizzare la rappresentazione dei falsi colori per evidenziare aree di diversa intensità.

Scegli una regione di interesse in cui verranno successivamente eseguite le misurazioni di singole molecole e una regione della stessa dimensione. Per la sottrazione di fondo, calcolare l'intensità integrata sottratta dallo sfondo. Ora rimuovi il filtro di densità ottica dal percorso del fascio di eccitazione, sbiancasci l'area e scatta un'immagine.

Vedrai la forza influenzale individuale diffondersi nell'area sbiancata. La singola forza influenzale è limitata dalla diffrazione con un diametro tipico di due o tre pixel, prende una regione di sette per sette pixel attorno a ogni singolo segnale della molecola e la seconda regione nelle vicinanze. Per la sottrazione di fondo, è importante quantificare il segnale della sola forza di fluor

Pertanto, è meglio visualizzare le proteine sullo strato BI con un rapporto proteine/proteine inferiore a uno o per le proteine specificamente marcate SAT. Ancora più rapporto dieta/proteine di uno, come mostrato nel nostro esempio, misurare le intensità integrate per entrambe le regioni e sottrarre lo sfondo dal segnale per non prendere l'ultimo evento osservato mostrato nel nostro esempio poiché lo sbiancamento si è probabilmente verificato durante l'esposizione media. I segnali corretti qui, lo facciamo per un'influenza su quattro, che osserviamo su nove fotogrammi.

Tuttavia, questa procedura dovrebbe essere eseguita per almeno diverse centinaia di eventi di singole molecole. Torniamo alla nostra immagine originale a doppio strato osservata a densità di potenza di eccitazione attenuata. La densità molecolare è determinata correggendo l'intensità integrata della regione di interesse per una bassa densità di potenza di eccitazione attraverso la moltiplicazione per cento e dividendola per l'intensità media della singola molecola e l'area.

Abbiamo a che fare con una densità di 421,4 Forza di fluorazione per micron quadrato. Nel nostro esempio, con un rapporto dieta/proteine di uno, questo equivale allo stesso numero di molecole per micron quadrato. Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di preparare e caratterizzare un doppio strato lipidico funzionalizzato con una proteina utilizzando la microscopia a fluorescenza a singola molecola.

Inoltre, è necessario conoscere i principi di base per modificare e aggiornare un microscopio standard per questo scopo. Successivamente utilizzeremo questa metodologia per determinare la cinetica di legame dell'antigene legato a doppio strato ai recettori delle cellule T legate alle cellule, ma molte altre applicazioni basate su questo sono certamente fattibili.