Protocollo chirurgico per una grande finestra cranica richiudibile che consente registrazioni elettrofisiologiche longitudinali e multimodali della rete in modalità predefinita del mouse

La Default Mode Network o DMN è una rete cruciale e su larga scala, implicata in una serie di funzioni cognitive e disturbi neuropsichiatrici come la depressione. Studiare le dinamiche complesse della DMN nei modelli animali fornisce preziose informazioni sul suo funzionamento sia in stati sani che patologici. Tuttavia, una sfida significativa è stata la realizzazione di registrazioni elettrofisiologiche stabili, a lungo termine e su larga scala dai molteplici nodi profondi e distribuiti, la DMN, in topi svegli e comportativi.

Qui presentiamo un nuovo protocollo chirurgico a due fasi sviluppato nel laboratorio di Eero Castren. Questa tecnica crea una grande finestra cranica duratura e richiudibile, permettendo registrazioni longitudinali ripetute da oltre 1.000 canali elettrodici simultaneamente. Questo si ottiene combinando la microelettrocorticografia a livello superficiale, micro-ECoG, con due sonde Neuropixel, permettendo un accesso senza precedenti alla Default Mode Network.

Questo video fornirà una guida passo dopo passo a questa robusta procedura chirurgica, dalla preparazione animale e l'impianto della placca frontale fino alla creazione della finestra cranica cronica, garantendo un'acquisizione di dati di alta qualità e a lungo termine per la ricerca neuroscientifica di rete. Tutte le procedure presentate sono state approvate dal National Experiment Board in Finlandia e sono conformi alla direttiva europea per la protezione degli animali utilizzati a scopi scientifici. Fase 1, Preparazione dell'Animale e Impianto della Corazza.

Per eseguire questa procedura, si inizia preparando tutti i materiali e le attrezzature chirurgiche necessarie. Anestesiare il topo con il 4% di isoflurano e mantenere l'anestesia tra l'1,5 e il 2,5% con un flusso di ossigeno di 0,5 litri al minuto. Rasi il pelo dalla sommità della testa e posiziona l'animale su una borsa riscaldante controllata dotata di un sensore di temperatura interno calibrato per mantenere la temperatura corporea a 37 gradi Celsius durante tutta la procedura.

Applica la pomata carbomerica per gli occhi per prevenire la secchezza corneale. Fissare il topo nel sistema stereotassico in modo che il cranio sia piatto e somministrare analgesici preoperatori e agenti antinfiammatori tramite iniezioni sottocutanee, Carprofene, Buprenorfina e Desametasone. Disinfettare l'area rasata con una soluzione di povidone-iodio e iniettare una soluzione di lidocaina-epinefrina come anestetico locale sotto la pelle del cuoio capelluto.

Fai una piccola incisione trasversa alla linea dell'orecchio e ingrandi progressivamente l'incisione fino a esporre completamente la parte superiore della superficie cranica. Pulire con attenzione il cranio esposto con acetone finché non è stato rimosso tutto il periosto visibile per garantire una forte adesione dell'impianto. Usa una lama smussata e circolare per rimuovere eventuali frammenti residui di tessuto periostico e connettivo che il lavaggio con acetone non ha completamente risolto.

Con il dispositivo stereotattico, segna un'area rettangolare di 4 millimetri per 7,6 millimetri sul cranio rispetto al bregma. Il rettangolo dovrebbe estendersi di due millimetri lateralmente dal bregma su entrambi i lati, tre millimetri rostralmente e 4,6 millimetri caudali. Successivamente, segna i due siti di inserimento della sonda intracranica sull'emisfero destro.

Segna il sito della sonda rostrale a 1,66 millimetri anteriore e 1,95 millimetri laterale rispetto al bregma, e il sito della sonda caudale a 2,2 millimetri posteriori e 1,9 millimetri laterali rispetto al bregma. Successivamente, incidi un motivo a croce su tutte le superfici ossee esposte al di fuori dell'area finestra designata utilizzando una lama chirurgica numero 11, e crea scanalature poco profonde ma definite di circa 0,2 a 0,4 millimetri per formare una griglia uniforme di circa un millimetro quadrato. Crea un applicatore di colla fine montando un ago sterile da 30G sulla punta di un cotton fioc e piega l'ago a forma di V.

Dispensa la colla cianoacrilato in una pesatrice di plastica usa e getta e immergi l'applicatore nel serbatoio della colla. Depositare della colla su ogni superficie ossea esposta e incisa, applicando non più di un singolo deposito per sito, così che la copertura sia approfondita, ma mai eccessiva. Lascia asciugare la colla per sette minuti prima di procedere.

Per impiantare la cavità di riferimento, si seleziona il sito di perforazione sopra la posizione sinistra del cervelletto per evitare vasi superficiali visibili. Forare il foro pilota in raffiche di cinque-dieci secondi usando una mava d'acciaio rotonda a 20.000-25.000 colpi al minuto finché il foro non diventa più traslucido, rivelando una sfumatura rosa chiaro. Inserire la presa di riferimento placcata oro nel foro pilota, fissarla con colla cianoacrilato e rinforzare la giunzione con cemento dentale polimerizzabile ai raggi UV.

Polimerizza il cemento dentale con una luce LED per un minuto. Successivamente, posizionare una piccola quantità di cemento dentale polimerizzabile ai raggi UV sull'apice dell'osso rostrale esposto e posizionare la piastra sotto il cranio in modo che un bordo poggi sull'impalcatura in cemento dentale, indurita attorno all'alcavo di riferimento e con il bordo opposto appoggiato sul nuovo dab di cemento rostrale. Assicurati che la piastra sia centrata e livellata.

Rinforzare la struttura applicando cemento dentale attorno alla base della piastra della testa e facendo circolare l'osso inciso e la cavità di riferimento finché non si forma un recinto continuo e sigillato attorno al perimetro della futura finestra cranica. Infine, ho polimerizzato il cemento dentali con la luce LED della penna per un minuto. Una volta che il cemento è completamente indurito, lascia che il topo si svegli dall'anestesia.

La prima fase è ora completata. Lascia che il mouse si riprenda per almeno 48 ore prima di passare alla fase successiva. Fase 2, Creazione cronica della finestra cranica.

La seconda fase richiede gli stessi strumenti e farmaci della prima, tranne l'anestetico locale. Inoltre, questa fase richiede una membrana PDMS sterile e sottile, liquido cerebrospinale freddo e artificiale conservato in ghiaccio, un sigillante in silicone elastomero e un cappuccio protettivo stampato in 3D su misura. Almeno 48 ore dopo il primo intervento, si ri-anestesia il topo con isoflurano, si applica la borsa riscaldante sul telaio stereotassico e si somministrano i farmaci preoperatori come nella prima fase, ad eccezione dell'anestetico locale lidocaina-epinefrina.

Inizia a assottigliare l'osso con il trapano dentale lungo il contorno rettangolare segnato nella Fase 1, partendo da 25.000 colpi al minuto con il dispositivo di perforazione tenuto a un angolo di 90 gradi rispetto alla superficie ossea, e esegui uno o due passaggi leggermente più profondi lungo i bordi rettangoli per stabilire una scanalatura iniziale di taglio. Forare scanalature poco profonde nell'osso e nel cemento dentale adiacenti alla finestra cranica alle due coordinate di inserimento della sonda. Questi solchi fungono da punti di riferimento visivi persistenti che rimangono visibili dopo la rimozione del lembo osseo e vengono utilizzati per riposizionare riproducibilmente le sonde intracraniche nelle successive sedute elettrofisiologiche.

Applicare regolarmente liquido cerebrospinale artificiale sterile e gelido durante la perforazione per prevenire danni termici alla corteccia sottostante e minimizzare il sanguinamento. Riduci progressivamente la velocità del trapano a 20.000 colpi al minuto man mano che l'osso si assottiglia. Continua a forare lungo il perimetro rettangolare finché l'osso all'interno del contorno non sarà sottigliato di circa il 90%.

Non forare completamente il cranio. Passa al gancio fine curvo in dura. Inserisci la punta sotto il bordo dell'osso sottile con estrema cautela e fai scorrere il gancio lungo il perimetro della finestra, staccando con cura il lembo osseo dal cranio circostante e dal tessuto sottostante.

Sollevare con attenzione il lembo osseo staccato con successo con il gancio della dura dura in direzione posteriore-anteriore fino a circa 35 gradi sopra la superficie del cranio. Afferra il bordo sollevato con la pinza e dondola delicatamente a sinistra e a destra finché la piastra non si libera completamente. Pulire delicatamente l'area esposta di sangue coagulato con ripetuti lavaggi di ACSF gelido.

Posizionare una singola membrana prefabbricata sterile del PDMS direttamente sotto la superficie durale una volta che il sanguinamento si è attenuato. Quando è dimensionato correttamente, copre la finestra con precisione e aderisce passivamente alla dura, tenendola appoggiata al cervello. Sigilla la craniotomia applicando un sigillante silicone.

Riempire ogni fessura tra il terrario in cemento dentale e il bordo interno della piastra testace, circondando e sovrapponendo completamente i bordi della membrana BDMS. Fissa un cappuccio protettivo personalizzato stampato in 3D sulla piastra con una piccola quantità di colla cianoacrilato per proteggere la finestra tra una sessione di registrazione e l'altra. Il topo è ora pronto per il recupero e dovrebbe essere trasferito nella gabbia di casa per una singola abitazione, per prevenire danni all'impianto.

Un intervento di successo si traduce in una finestra chiara e trasparente sulla corteccia, con vascolarizzazione visibile e minimi segni di infiammazione o infezione. Questa chiarezza può essere mantenuta per oltre 21 giorni, permettendo studi longitudinali a lungo termine. I segnali elettrofisiologici grezzi registrati attraverso la finestra cronica mantennero alta qualità lungo la linea temporale longitudinale.

Qui, tracce rappresentative di micro-ECoG a banda larga campionate da una griglia retrospleniale posteriore e tracce simultanee di potenziale di campo locale con sonda intracranica campionate da un canale corticale superficiale sono mostrate affiancate per il primo giorno di registrazione e i 21 giorni successivi. Le registrazioni del giorno 21 mostrano un'ampiezza del segnale comparabile, contenuto spettrale e assenza di artefatti di movimento e rumore rispetto alle registrazioni del giorno 0 dello stesso animale, confermando che né la presenza cronica della membrana PDMS e del sigillo in silicone né le ripetute punture durali hanno introdotto una degradazione rilevabile sia della superficie che della sonda intracranica negli strati corticali superficiali, dove ci si aspetterebbe che la degradazione emergesse per prima. La validazione primaria di questa tecnica è l'acquisizione di dati elettrofisiologici multimodali stabili e di alta qualità nel tempo.

La finestra richiudibile consente l'inserimento ripetuto di sonde per registrare le stesse popolazioni neuronali nel corso di settimane. Attraverso la banda alfa, le matrici di valori di blocco di fase calcolate dai canali lungo la sonda caudale ad alta densità dell'elettrodo intracranico mostrano un'architettura funzionale stabile tra la base e la sessione post-trattamento del giorno 21. Questo mostra una reinserzione riproducibile nella stessa posizione corticale piuttosto che una tracciatura formale degli stessi singoli neuroni.

Sebbene una piccola traslazione di intercessione del fusto escluda una rivendicazione della stessa unità, la struttura aggregata laminare e regionale delle interazioni a banda alfa viene preservata, supportando che la finestra cronica consente il campionamento longitudinale dello stesso circuito funzionale. Per verificare direttamente che la finestra cronica supporti il targeting laminare riproducibile delle stesse strutture profonde tra le sessioni, sono state calcolate mappe di densità di sorgenti di corrente o CSD dai canali LFP delle sonde. I profili CSD evocati da stimoli mostrano che le attese firme di sorgente laminare del sink, inclusa la corteccia prelimbica e l'area cingolata anteriore, sono preservate tra una sessione e l'altra.

Le sovrapposizioni del profilo di potenza laminare tra le due sessioni sono molto simili tra le sessioni, con la correlazione di Pearson di 0,81. Le differenze osservate nella corteccia motoria secondaria sono probabilmente dovute a differenze di movimento tra le registrazioni. Poiché il grafico CSD trasporta informazioni anatomiche, può fornire una lettura non terminale all'interno della sessione di quali regioni cerebrali ciascuna sonda sta attualmente campionando, indipendentemente dalle colorazioni tessuti post-mortem.

La riproducibilità della posizione micro-ECoG superficiale tra le sessioni viene quantificata indipendentemente dalla lettura intracranica della CSD. Vengono sovrapposte mappe di potenza spaziale a banda limitata calcolate dalla griglia micro-ECoG nel Giorno 0 e Giorno 21, e la correlazione pixel per pixel delle due mappe viene calcolata separatamente per le sottogriglie rostrale e caudale. Le correlazioni dei profili della sottogriglia rimangono elevate e i codici a barre spaziali delle due sessioni hanno visibilmente co-localizzato gli stessi punti caldi di potenza corticale sia sulla metà rostrale che su quella caudale dell'array.

Una coda di allineamento sinusoidale visibile attraverso la griglia traslucida insieme alle scanalature ossee incise alle coordinate di inserimento della sonda supporta quindi la riproducibilità su scala millimetrica del posizionamento micro-ECoG nell'intervallo longitudinale di 21 giorni. Per convalidare ulteriormente la tecnica, sono state eseguite colorazioni immunoistochimiche per GFAP e IBA1 in fette cerebrali post-mortem circa quattro settimane dopo l'intervento di craniotomia. La GFAP è espressa dagli astrociti, che sono sovraregolati nella gliosi reattiva come lesioni cerebrali o infiammazione.

IBA1, invece, è espresso dalle microglie, che sono più attive durante i processi neuroinfiammatori. La coorte di convalida era composta da animali in cui è stato eseguito l'intero intervento chirurgico a due fasi e la finestra cranica è stata successivamente riaperta tre volte nei giorni postoperatori 0, 21 e 22. Tuttavia, in questa coorte non sono stati effettuati collocamenti di micro-ECoG né inserzioni intracraniche di sonde.

La finestra veniva risigillata tra una sessione e l'altra, come durante una registrazione elettrofisiologica. Questa coorte isola quindi il contributo infiammatorio della finestra cronica e dell'esposizione durale ripetuta da eventuali danni tissutali indotti dalla sonda. Non sono state osservate differenze significative in nessuno dei marcatori tra il gruppo di controllo senza intervento chirurgico e il gruppo veicolo sottoposto all'intervento.

Queste micrografie rappresentative non mostrano prove qualitative di gliosi reattiva o attivazione microgliale nella regione direttamente sottostante alla finestra. Tuttavia, è stato osservato un leggero aumento dell'attivazione microgliale e degli astrociti adiacente alla traiettoria della sonda e nell'emisfero dell'inserimento della sonda rispettivamente, probabilmente dovuto a una velocità di inserimento troppo elevata della sonda intracranica. Un intervento chirurgico riuscito si traduce in una finestra trasparente e chiara sulla corteccia con infiammazione minima.

Dopo il periodo di trattamento cronico, può verificarsi un certo gonfiore cerebrale. Questo può essere gestito con un attento monitoraggio e, se necessario, la somministrazione di ulteriori analgesici. Per le registrazioni, basta rimuovere il tappo e il sigillante, posizionare le griglie micro-ECoG e le sonde Neuropixel e iniziare l'acquisizione dati dall'animale sveglio e in fase di comportamento.

In sintesi, questo protocollo chirurgico a due fasi fornisce un metodo affidabile ed altamente efficace per creare una vasta finestra cranica cronica nei topi. I principali vantaggi della procedura sono i danni minimi alla dura dura e l'ampia esposizione che fornisce, fondamentale per il posizionamento simultaneo sia delle griglia micro-ECoG superficiali sia delle sonde Neuropixel profonde del cervello. Questo metodo consente un'indagine longitudinale senza precedenti della dinamica elettrofisiologica a livello di rete nel DMN e in altri circuiti su larga scala.

Apre la porta a indagini più approfondite sulle basi neurali dei comportamenti complessi e sulla fisiopatologia dei disturbi cerebrali, contribuendo infine allo sviluppo di terapie innovative.