Analisi morfometriche della forma: il software di analisi per la quantificazione della forma craniofacciale nel pesce zebra
February 27th, 2026
Questo lavoro descrive un protocollo per quantificare la forma della cartilagine craniofacciale utilizzando software liberi (tpsDigs2, MorphoJ e PAST) per misurare i cambiamenti nella struttura facciale nelle larve di pesce zebra.
La nostra ricerca utilizza software morfometrici per quantificare se etanolo e bmp7a interagiscono causando sottili difetti craniofaciali nei pesci zebra. Le misure lineari perdono cambiamenti sottili. Con questo metodo, utilizziamo i punti di riferimento per quantificare i cambiamenti di forma controllando al contempo le differenze di dimensione.
Per cominciare, apri il software tpsDigs2. Clicca su Input source, poi su File e seleziona il file TPS Notepad salvato. Clicca su Opzioni per visualizzare l'opzione Strumenti Immagine.
Imposta la lunghezza di riferimento a 100 micrometri e premi su Imposta scala. Clicca su OK per confermare i parametri di scala, poi esci dalla finestra degli strumenti Immagine. Poi, clicca sul simbolo di mira e posiziona il primo punto di riferimento all'articolazione mediana tra le cartilagini del Meckel.
Posizionare i secondi punti di riferimento alle articolazioni bilaterali tra le cartilagini di Meckel e le cartilagini palatoquadrate. Posizionare il terzo punto di riferimento all'articolazione mediana tra le cartilagini ceratoiale e il quarto punto di riferimento alle articolazioni bilaterali tra le cartilagini palatoquadrate e ceratoiali. Poi, posizionare i quinti punti di riferimento all'estremità distale delle cartilagini iomandibolari, assicurandosi che i punti di riferimento siano posizionati nello stesso ordine per ogni immagine.
Dopo aver posizionato i punti di riferimento, clicca su File per aprire il menu a tendina. Seleziona Salva dati, poi Sovrascrive per salvare il file aggiornato. Esci dal software tpsDigs2.
Avvia il software MorphoJ. Clicca su File, seleziona Crea nuovo dataset e assegna un nome al dataset. Clicca su TPS e seleziona il file Notepad contenente i nuovi dati aggiunti.
Poi, crea il dataset. In Project Tree, clicca sul dataset. Seleziona i preliminari, poi il nuovo Procruste Fit.
Scegli Allineare per assi principali e clicca su Esegui Adattamento Procrusto. In Preliminari, seleziona Genera Matrice di Covarianza per ottenere le coordinate di procrosto. Esegui la funzione quando ti viene richiesto.
Ora, seleziona Crea o Modifica Wireframe e collega i punti sulle immagini. Clicca sui punti collegati e accetta o crea l'immagine, poi modifica i classificatori secondo necessità. Apri un programma di fogli di calcolo mantenendo aperto MorphoJ.
Inserisci le informazioni del classificatore come GENOTYPE, TREATMENT e GENOTYPE TREATMENT, poi salva il file come file CSV. In MorphoJ, clicca su File e seleziona Importa Variabili di Classificatore per importare il file CSV. Torna all'Albero dei Progetti e clicca sul dataset.
Sotto Preliminari, seleziona Modifica Classificatori per confermare che tutte le immagini siano incluse. In Project Tree, seleziona CovMatrix, poi clicca su Variazione in cima alla pagina. Seleziona Analisi delle componenti principali per calcolare i punteggi delle componenti principali.
Clicca su punteggi PC per visualizzare il grafico generato. Clicca con il tasto destro sul grafico e seleziona Ellissi di Fiducia per aggiungere il classificatore desiderato. Seleziona Colori Punti Dati, assegna i colori e clicca su OK per applicare le modifiche.
Sotto Preliminari, seleziona Opzioni impostate per il Shape Graph situato in basso sullo schermo. Scegli i Wireframe Graphs e modifica i colori della forma di destinazione, della forma iniziale e dei numeri. Seleziona la variazione, poi scegli Procrustes ANOVA.
Esporta i risultati dell'ANOVA procrustes nel file di foglio di calcolo precedentemente creato. In MorphoJ, seleziona il dataset originale nel Project Tree. Clicca su Confronto, poi su Analisi Variabile Canonica.
Seleziona le variabili classificatrici GENOTYPE TREATMENT ed esegui la funzione. Per esportare i risultati, clicca sulla scheda Risultati e clicca con il tasto destro sulla pagina dei risultati. Seleziona Esporta in File e salva i risultati.
Nell'Albero del Progetto, seleziona Analisi Variabile Canonica, poi punteggi. Clicca su File, scegli Esporta Dataset, seleziona il tipo di dato e GENOTYPE TREATMENT. Salva i punteggi CVA come file TXT.
Per preparare il file al software PAST, apri i punteggi CVA salvati in un editor di testo. Sostituisci il termine id nell'angolo in alto a sinistra con Etichetta e salva il file modificato. Apri il software PAST e clicca su File, poi apri per selezionare il file dei punteggi CVA modificato.
Nella finestra di importazione. Seleziona Nomi, dati per riga e colonna e Tab come separatore, poi clicca su Importa. Nella scheda Mostra, seleziona attributi Colonna.
Nel menu a tendina accanto a Type, assegna Group alla prima colonna contenente variabili classificatori. Evidenzia le colonne dei componenti principali o delle variabili canoniche. Seleziona Multivariato, poi Test, e scegli Normalità Multivariata per eseguire separatamente il test di normalità per i dati delle componenti principali e dei variabili canonici.
Clicca sulla cella grigia vuota nell'angolo in alto a sinistra sopra Tipo per selezionare l'intero dataset. Seleziona Multivariato, poi Test e scegli analisi multivariata delle varianti per eseguire l'analisi. Esporta i risultati di MANOVA nel file di foglio di calcolo precedentemente creato.
Sono state acquisite immagini del viscerocranio per ogni larva di ogni genotipo e gruppo di trattamento. Le cartilagini del viscerocranio sono state etichettate in un'immagine rappresentativa e sono state posizionate delle riferite su ciascuna immagine per generare set di dati etichettati come punti di riferimento. Il componente principale 1 rappresentava circa il 34% della variazione totale della forma e il componente principale 2 il 20% della variazione totale della forma.
Ogni componente principale mostrava una variazione specifica nella forma viscerocranica rispetto alla forma media di tutti i viscerocrani. Il grafico di analisi delle componenti principali ha mostrato medie sovrapposte tra i gruppi genotipo e terapeutico senza un cluster distinto. Le larve di tipo selvatico trattate con etanolo hanno mostrato una grande ellisse di fiducia del 95% della media a causa della bassa dimensione del campione.
La variazione canonica 1 rappresentava un sottile accorciamento o allungamento dell'articolazione ceratoiale nel filo magenta rispetto al filo nero medio. La variazione canonica 2 mostrava uno spostamento medialmente solo su un lato del viscerocranio alle articolazioni tra il palatoquadrato di Meckel e il palatoquadrato-ceratoiale. Le larve di tipo selvatico trattate con etanolo hanno mostrato una grande ellisse del 95% di fiducia della media che si sovrapponeva a tutti gli altri gruppi.
L'analisi multivariata delle varianti ha rivelato un effetto complessivo significativo del genotipo e del trattamento. Il montaggio costante dei campioni è la sfida più grande. Una larva inclinata può causare misurazioni imprecise e alterare i risultati.
Questo protocollo si adatta a diverse strutture anatomiche, analizza dati 3D, genera misure lineari e aiuta a determinare le dimensioni dei campioni sperimentali. Studi futuri indageranno altre sensibilità al genotipo dell'etanolo, amplieranno le dimensioni dei campioni e applicheranno questa versatile cassetta degli attrezzi a varie strutture anatomiche.
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Overview
This article presents a detailed morphometric protocol for analyzing subtle craniofacial shape changes in zebrafish larvae following ethanol exposure, with a focus on gene-ethanol interactions. The approach leverages landmark-based geometric morphometrics and multivariate statistical analyses to quantify and compare facial skeletal variation, addressing challenges in assessing fetal alcohol spectrum disorders (FASD) phenotypes.
Key Study Components
Area of Science
- Developmental biology
- Genetics
- Morphometrics
- Toxicology
Background
- FASD encompasses a range of physical, cognitive, and behavioral disabilities caused by prenatal ethanol exposure.
- Facial skeletal abnormalities are a hallmark of FASD, but their analysis is complicated by genetic variability and subtle shape changes.
- Zebrafish are an effective model due to genetic similarity to humans, external fertilization, conserved craniofacial structures, and transparent larvae.
- Traditional linear measurements may miss subtle or complex shape changes, necessitating advanced morphometric approaches.
Purpose of Study
- To quantify subtle craniofacial defects resulting from ethanol and bmp7a gene interactions in zebrafish.
- To develop and demonstrate a reproducible workflow for landmark-based morphometric analysis of craniofacial shape.
- To enable pairwise and multivariate comparisons of facial morphology across genotypes and treatments.
Methods Used
- Landmark placement on viscerocranial cartilage images using tpsDigs2 software.
- Procrustes alignment, principal component analysis (PCA), and canonical variate analysis (CVA) using MorphoJ.
- Multivariate normality and MANOVA tests using PAST software.
- Statistical visualization and export of results for further analysis.
Main Results
- Principal component 1 and 2 accounted for 34% and 20% of total shape variation, respectively.
- PCA plots showed overlapping means among genotype and treatment groups, with no distinct clustering.
- Canonical variate analysis revealed subtle, localized shape changes in the viscerocranium, such as shortening/lengthening of the ceratohyal joint and medial shifts at specific cartilage joints.
- MANOVA indicated a significant overall effect of genotype and treatment on craniofacial shape.
Conclusions
- The morphometric protocol enables detection of subtle craniofacial shape changes that linear measures may miss.
- Consistent sample mounting is critical to avoid measurement artifacts.
- This workflow is adaptable to other anatomical structures and can be extended to 3D data and larger sample sizes in future studies.
Frequently Asked Questions
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:24
Adding Landmarks to Zebrafish Larvae Viscerocranium Images Using tpsDigs2 Software
1:48
Using MorphoJ to Analyze Cranofacial Shape by Procrustes ANOVA
4:26
Canonical Variate Analysis of the Dataset and MANOVA in PAST Software
6:43
Results
8:30
Conclusion
