Uno strumento di analisi che quantifica Modifiche morfologia cellulare dalle immagini a fluorescenza tridimensionali

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire un metodo automatizzato per analizzare e quantificare i cambiamenti nella morfologia di una cellula di forma indefinita presi da immagini tridimensionali a fluorescenza confocale. Ciò si ottiene eseguendo prima l'esperimento di stimolazione chimica per includere le cellule trattate con cellule agoniste, trattate con antagonista, seguite da agonisti e cellule senza trattamento. Le cellule vengono quindi preparate per l'analisi in immunofluorescenza.

Il secondo passo consiste nell'acquisire immagini a fluorescenza tridimensionale multispettrale. Successivamente l'analisi morfometrica tridimensionale viene eseguita utilizzando ameris neuroscience, ameris XT e i software MATLAB. I cambiamenti fenotipici delle singole cellule visualizzati attraverso l'analisi morfometrica tridimensionale vengono quindi analizzati e quantificati come passaggio finale.

In definitiva, questa piattaforma software viene utilizzata per quantificare i cambiamenti nella forma cellulare in seguito all'attivazione del recettore, fornendo uno strumento aggiuntivo per la scoperta di farmaci. In generale, il ricercatore ha un'esperienza standard nel sistema biologico, potrebbe non avere familiarità con l'applicazione del computer. In questo protocollo nel modulo I 60, colmare il divario tra la visualizzazione e il linguaggio informatico Prima dell'inizio di questa procedura.

Trasfettare le cellule renali embrionali umane con emoagglutinina marcata con il recettore del fattore di rilascio della corticotropina due o CRF R due come indicato nel protocollo scritto. CFR 2 è un recettore accoppiato a proteine G o GPCR. Il giorno dopo la trasfezione, il coperchio della fiamma scivola e li mette in una piastra a sei pozzetti.

Aggiungere 10 millilitri di PBS a una fiala di cinque milligrammi di polilisina liofilizzata e mescolare. Quindi diluire cinque millilitri di polilisina disciolta in 500 millilitri di PBS e aggiungere due millilitri della miscela su ciascuno dei vetrini. Lasciare la piastra con i vetrini coprioggetti a temperatura ambiente per 20 minuti Dopo 20 minuti, lavare i vetrini aggiungendo due millilitri di PBS e poi rimuovendo, ripetere questo processo due volte.

Dopo l'edizione di due millilitri di DMEM con il 10% di terreno FBS, aggiungere da due a cinque gocce di celle sui vetrini. Le cellule devono essere alla concentrazione necessaria per raggiungere il 60% di fluenza. Il giorno dopo.

Incubare le cellule per una notte a 37 gradi Celsius il giorno successivo. Verificare che le cellule siano confluenti al 60% per il trattamento con agonisti. Stimolare le cellule designate sostituendo i terreni con due millilitri di terreno integrati con il fattore di rilascio della corticotropina del ligando endogeno CRF R a una concentrazione di un micromolare.

Incubare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius per 30 minuti affinché le cellule vengano pretrattate con antagonista. Sostituire il terreno con due millilitri di terreno integrato con il selettivo CFR due antagonisti anti recupero 30 ad una concentrazione di un micromolare. Incubare le cellule in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Dopo il trattamento con antagonisti. Stimolare le cellule con l'agonista CRF e incubarlo a 37 gradi Celsius per 30 minuti per le cellule non trattate. Sostituire il terreno con due millilitri di terreno fresco dopo il trattamento.

Sostituire il terreno in ogni pozzetto con due millilitri di terreno fresco e aggiungere l'anti HHA diluito da uno a mille, dopo un'incubazione di 60 minuti a 37 gradi Celsius. Aspirare il terreno e aggiungere due millilitri di fissativo a ciascuno. Incubare bene la piastra a temperatura ambiente per 20 minuti dopo aver aspirato il fissativo.

Lavare le celle tre volte con soluzione salina tris puffered. Caino. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di sangue sopra ogni coperchio, far scorrere e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi aspirare la soluzione di blotto esistente dai pozzetti e aggiungere 100 microlitri di cocktail di anticorpi secondari freschi su ciascun vetrino coprioggetti dopo un'incubazione di 45 minuti a temperatura ambiente al buio, lavare quattro volte con TBSC, aggiungendo e rimuovendo delicatamente la soluzione dalla parete laterale del pozzetto mentre è ancora nella soluzione di lavaggio finale.

Raccogli ogni vetrino coprioggetto con un ago e una pinza curva. Posizionare le celle del vetrino coprioggetto rivolte verso il basso su un vetrino con una goccia di mezzo di montaggio Vector Shield con Dappy Fix con smalto per unghie e lasciare asciugare per 15-20 minuti. Alexa, 4 88 nanometri coniugato musa anticorpo viene utilizzato per visualizzare CFR due e DAPI viene utilizzato per visualizzare i nuclei stadio mitotico per iniziare a montare le cellule fisse su un microscopio fluorescente per limitare la soggettività sperimentale, mantenere le condizioni sperimentali sconosciute fino a dopo che le immagini vengono acquisite e analizzate per acquisire immagini.

Un obiettivo DIC a olio acro mat piano con ingrandimento 63 x e apertura numerica di 1,4 è stato utilizzato in combinazione con il microscopio metaconfocale zeis LSM five 10 collegato a un sistema laser a due fotoni integrato coerente Durante il processo di acquisizione dei dati, compartimentalizzare le cellule sia mediante partizionamento multicanale che c per includere i dati dalla membrana nucleare alle estremità esterne del recettore extracellulare. Elabora i dati di fluorescenza utilizzando amris, che consente la visualizzazione e la segmentazione di un set di dati di microscopia 3D. Seguendo l'algoritmo progettato da Amaris, utilizzare prima il rendering della superficie per rappresentare la membrana nucleare NU.

Amaris determinerà se c'è più di un nucleo nella regione di interesse, o ROI. Successivamente, utilizza l'algoritmo di creazione dei punti per individuare i due punti di estensione del CFR. Compensa il rumore di fondo e l'intensità irregolare della complessa rete di celle di forma amorfa per massimizzare l'inclusione di ciascuna unità di rilevamento della fluorescenza di CFR due, impostare il diametro dei punti a 0,2 micrometri, che è l'unità più piccola all'interno dell'immagine.

Ciò consente l'estrapolazione di informazioni distinte sotto forma di intensità misurata. Utilizzando un filtro gaussiano, incorporare il filtro spot nel processo di creazione automatizzata dello spot. Per evitare la catione dei dati, convertire il set di dati da virgola fissa a otto bit a 32 bit in virgola mobile.

Seleziona la superficie creata e determina l'esatta posizione spaziale di ogni punto al di fuori della superficie nucleare eseguendo una trasformazione della distanza utilizzando la membrana nucleare come punto di riferimento. Scambia i dati delle intensità dei voxel con i dati delle coordinate spot utilizzando il modulo ameris XT interfacciato con MATLAB. Selezionare gli spot e selezionare le statistiche codificate in tipo statistico.

Scegliere il centro di intensità riportato nel nuovo canale creato. Caricare il colore desiderato per la visualizzazione e impostare l'intervallo della mappa dei colori per l'analisi. I dati numerici possono essere visualizzati nella scheda statistica ed esportati in excel utilizzando il prisma GraphPad.

Quantificare i dati risultanti e presentarli in formato grafico per l'analisi statistica. Eseguire confronti tra gruppi utilizzando i dati a due vie Inova e Bonferroni post-test presentano i dati come media più o meno deviazione standard. Per dimostrare la potenza di questo approccio, i cambiamenti cellulari che derivano dall'interazione dei recettori accoppiati a proteine G e del recettore del fattore di rilascio della corticotropina due con il suo ligando endogeno CRF.

Nelle cellule HT K 2 93 trasfettate sono state quantificate, le immagini unite sono state visualizzate utilizzando Alexa 4 88 coniugato, anti topo, anticorpo secondario e DPI per visualizzare i nuclei. I risultati rivelano che i recettori CRF R due si trovano nella membrana plasmatica e proiettano da regioni finite della membrana delle cellule. Utilizzando l'analisi 2D convenzionale, è possibile rilevare questo sottogruppo di recettori extracellulari CRF R due solo se vengono analizzati i punti di adesione del recettore sulle coperture di vetro.

Di conseguenza, qualsiasi altra informazione derivata dai dati MULTISPETTRALI impilati ZS viene persa. Il risultato non ha scelto alcuna differenza tra nessun trattamento e agonista. Mentre i punti di adesione dei recettori sono notevolmente diversi quando le cellule vengono trattate con CRF, i recettori extracellulari sono notevolmente ridotti, come dimostrato dalla diminuzione della distanza delle macchie dalla membrana plasmatica.

Vengono anche ridistribuiti da posizioni principalmente limitate in una serie di posizioni discrete. L'effetto della CRF sulla distribuzione della membrana recettoriale è prevenuto dal pretrattamento con i due antagonisti specifici della CR. 30 30.

In queste condizioni, le due estensioni CRFR non cambiano con il trattamento CRF. La distribuzione distale delle macchie tracciate in intervalli di cinque micrometri con codice colore viene utilizzata per visualizzare la distanza dei voxel dalla membrana nucleare. Nessun trattamento e il pre-trattamento con antagonisti prima del trattamento con agonisti non ha mostrato differenze significative nella contrazione del GPCR.

Il trattamento delle cellule con l'agonista CRF riduce progressivamente il numero di CFR due contenenti voxel rispetto a nessun trattamento o rispetto alle cellule. Pretrattato con antagonista As dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha permesso ai ricercatori nel campo della tecnica di imaging di quantificazione di esplorare e caratterizzare numerosi cambiamenti fenotipici di singole cellule, rendendo questo saggio basato su cellule un ulteriore strumento di profilazione di singole cellule per il processo di scoperta di farmaci.