Uno strumento di analisi che quantifica Modifiche morfologia cellulare dalle immagini a fluorescenza tridimensionali

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un metodo automatizzato per analizzare e quantificare i cambiamenti nella morfologia di una cellula con forma indefinita, acquisita da immagini tridimensionali a fluorescenza confocale. Questo viene realizzato innanzitutto eseguendo un esperimento di stimolazione chimica che comprende cellule trattate con agonista, cellule trattate con antagonista e successivamente con agonista, e cellule senza trattamento. Le cellule vengono quindi preparate per l'analisi di immunofluorescenza.

Il secondo passaggio consiste nell'acquisire immagini tridimensionali di fluorescenza multispettrali. Successivamente, viene effettuata un'analisi morfometrica tridimensionale mediante il software informatico ameris neuroscience, ameris XT e MATLAB. I cambiamenti fenotipici a livello di singola cellula visualizzati tramite l'analisi morfometrica tridimensionale vengono quindi analizzati e quantificati come passaggio finale.

In definitiva, questa piattaforma software viene utilizzata per quantificare i cambiamenti nella forma cellulare a seguito dell'attivazione del recettore, fornendo uno strumento aggiuntivo per la scoperta di farmaci. Generalmente, i ricercatori possiedono competenze standard nei sistemi biologici, ma potrebbero non essere familiari con le applicazioni informatiche. In questo protocollo del modulo I 60, si colma il divario tra la visualizzazione dei dati e il linguaggio informatico prima dell'inizio di questa procedura.

Trasfettare cellule renali embrionali umane con il recettore del fattore di rilascio della corticotropina due marcato con emagglutinina o CRF R due, come indicato nel protocollo scritto. CRF due è un recettore accoppiato alla proteina G o GPCR. Il giorno successivo al trasfezione, bruciare le lamelle e posizionarle in una piastra a sei pozzetti.

Aggiungere 10 millilitri di PBS a un flaconcino contenente 5 milligrammi di polilisina liofilizzata e mescolare. Successivamente, diluire 5 millilitri di polilisina disciolta in 500 millilitri di PBS e aggiungere 2 millilitri della miscela su ciascun coprioggetto. Lasciare la piastra con i coprioggetti a temperatura ambiente per 20 minuti. Dopo 20 minuti, lavare i coprioggetti aggiungendo 2 millilitri di PBS e quindi rimuovendola; ripetere questo processo due volte.

Dopo l'aggiunta di due millilitri di media DMEM con FBS al 10%, aggiungere da due a cinque gocce di cellule sui coverslip. Le cellule devono avere la concentrazione necessaria per raggiungere una confluenza del 60%. Il giorno successivo.

Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius il giorno successivo. Verificare che le cellule siano confluenti al 60% per il trattamento con agonista. Stimolare le cellule designate sostituendo il mezzo con due millilitri di mezzo integrato con il ligando endogeno CRF R due, fattore di rilascio della corticotropina, a una concentrazione di un micromolare.

Incubare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius per 30 minuti affinché vengano pretrattate con l'antagonista. Sostituire il mezzo con due millilitri di mezzo integrato con l'antagonista selettivo CFR2 anti salvaging 30 a una concentrazione di un micromolare. Incubare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Dopo il trattamento con l'antagonista, stimolare le cellule con l'agonista CRF e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti per le cellule non trattate. Sostituire il mezzo con due millilitri di mezzo fresco dopo il trattamento.

Sostituire il mezzo in ogni pozzetto con due millilitri di mezzo fresco e aggiungere anti HHA diluito uno a mille, successivamente a un'incubazione di 60 minuti a 37 gradi Celsius. Aspirare il mezzo e aggiungere due millilitri di fissativo a ciascun pozzetto. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 20 minuti dopo aver aspirato il fissativo.

Lavare le cellule tre volte con soluzione salina tamponata al tris. Aggiungere 100 microlitri di soluzione ematica sopra ciascun coverslip e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi aspirare la soluzione esistente dai pozzetti e aggiungere 100 microlitri di un'adeguata soluzione del cocktail di anticorpi secondari su ogni coverslip. Dopo un'incubazione di 45 minuti a temperatura ambiente al buio, lavare quattro volte con TBSC aggiungendo e rimuovendo delicatamente la soluzione dalla parete laterale del pozzetto, mantenendosi ancora nella soluzione di lavaggio finale.

Prendere ogni coprivetro con un ago e una pinzetta curva. Posizionare il coprivetro con le cellule rivolte verso il basso su un vetrino con una goccia di mezzo di montaggio Vector Shield con Dappy Fix, sigillare con lo smalto per unghie e lasciare asciugare per 15-20 minuti. L'anticorpo coniugato Alexa 488 nm viene utilizzato per visualizzare CFR2 e il DAPI viene utilizzato per visualizzare i nuclei. Allo stadio mitotico iniziale, montare le cellule fissate su un microscopio a fluorescenza. Per ridurre al minimo la soggettività sperimentale, mantenere le condizioni sperimentali sconosciute fino a dopo l'acquisizione e l'analisi delle immagini.

È stato utilizzato un obiettivo ad immersione in olio plan acro matico con ingrandimento 63x e apertura numerica 1,4 in combinazione con il microscopio confocale Zeiss LSM 510 Meta collegato a un sistema laser a due fotoni integrato Coherent. Durante il processo di acquisizione dei dati, compartimentalizzare le cellule sia mediante multicanale che mediante partizione c per includere dati che vanno dalla membrana nucleare fino alle estremità recettoriali extracellulari. Elaborare i dati di fluorescenza utilizzando Amaris, che consente la visualizzazione e la segmentazione di un dataset microscopico tridimensionale. Seguendo l'algoritmo progettato da Amaris, utilizzare innanzitutto la rappresentazione della superficie per visualizzare la membrana nucleare NU.

Amaris determinerà se è presente più di un nucleo nella regione di interesse, o ROI. Successivamente, utilizzare l'algoritmo di creazione dei punti per localizzare i due punti di estensione di CFR. Per compensare il rumore di fondo e l'intensità irregolare della rete complessa di cellule con forma amorfa e massimizzare l'inclusione di ciascuna unità di rilevamento della fluorescenza di CFR due, impostare il diametro dei punti a 0,2 micrometri, che è l'unità più piccola all'interno dell'immagine.

Questo consente l'estrapolazione di informazioni distinte sotto forma di intensità misurata. Utilizzando un filtro gaussiano, incorporare il filtraggio dei punti nel processo automatico di creazione dei punti. Per evitare la cattura dei dati, convertire il set di dati da punto fisso a 8 bit a float a 32 bit.

Selezionare la superficie creata e determinare la posizione spaziale esatta di ciascun punto al di fuori della superficie nucleare eseguendo una trasformazione della distanza utilizzando la membrana nucleare come punto di riferimento. Convertire i dati di intensità dei voxel in dati di coordinate dei punti utilizzando il modulo ameris XT interfacciato con MATLAB. Selezionare i punti e selezionare il codice statistico nel tipo statistico.

Scegliere il centro di intensità riportato nel nuovo canale creato. Caricare il colore desiderato per la visualizzazione e impostare l'intervallo della mappa di colori per l'analisi. I dati numerici possono essere visualizzati nella scheda statistica ed esportati in Excel utilizzando GraphPad Prism.

Quantificare i dati ottenuti e presentarli in formato grafico per l'analisi statistica. Eseguire il confronto tra i gruppi mediante analisi della varianza a due vie (two-way Inova) e test post-hoc di Bonferroni, presentando i dati come media ± deviazione standard. Per dimostrare l'efficacia di questo approccio, si osservano i cambiamenti cellulari risultanti dall'interazione tra i recettori accoppiati a proteine G e il recettore per il fattore di rilascio della corticotropina di tipo due con il suo ligando endogeno CRF.

In cellule HT K 2 93 transfezionate sono state quantificate immagini sovrapposte, visualizzate mediante un anticorpo secondario coniugato ad Alexa 4 88 anti topo e DPI per visualizzare i nuclei. I risultati mostrano che i recettori CRF R due si trovano nella membrana plasmatica e si proiettano da regioni specifiche della membrana cellulare. Utilizzando un'analisi convenzionale in 2D, è possibile rilevare questo sottoinsieme di recettori extracellulari CRF R due solo se vengono analizzati i punti di adesione del recettore sui coverslip di vetro.

Di conseguenza, qualsiasi altra informazione derivata dai dati MULTISPECTRAL sovrapposti di ZS viene perduta. Il risultato non mostra alcuna differenza tra l'assenza di trattamento e il trattamento con agonista. Mentre i punti di adesione del recettore risultano drasticamente diversi quando le cellule sono trattate con CRF, i recettori extracellulari sono notevolmente ridotti, come dimostrato dalla diminuzione della distanza dei punti dalla membrana plasmatica.

Vengono inoltre ridistribuiti da posizioni principalmente finite a un certo numero di posizioni distinte. L'effetto del CRF sulla distribuzione dei recettori nella membrana è prevenuto dal pretrattamento con gli antagonisti specifici del CR2. 30 30.

In queste condizioni, le due estensioni di CRFR non cambiano con il trattamento con CRF. La distribuzione distale dei punti tracciati in intervalli di cinque micrometri codificati con colori dello spettro viene utilizzata per visualizzare la distanza dei voxel dalla membrana nucleare. L'assenza di trattamento e il pretrattamento con antagonista prima del trattamento con agonista non hanno mostrato differenze significative nella contrazione del GPCR.

Il trattamento delle cellule con l'agonista CRF riduce progressivamente il numero di voxel contenenti CFR due, rispetto a nessun trattamento o rispetto alle cellule non trattate. Pretrattate con l'antagonista As dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle tecniche di imaging quantitativo per esplorare e caratterizzare numerose modifiche fenotipiche a livello di singola cellula, rendendo questo saggio cellulare uno strumento aggiuntivo di profilazione a singola cellula nel processo di scoperta di farmaci.