Sintesi, incapsulamento dell'emoglobina e PEGilazione biortogonale in nanoparticelle gerarchicamente porose di UiO-66 per applicazioni di somministrazione di ossigeno

Lo scopo di questa ricerca è definire una struttura metallica-organica stabile, una nanoparticella basata su MOF per l'incapsulamento dell'emoglobina e la somministrazione di ossigeno. La morfologia porosa di Hierarch può superare la limitazione di dimensione del palo per l'incapsulamento dell'emoglobina, e la popolazione superficiale può migliorare la stabilità delle particelle negli ambienti fisiologici. Per cominciare, pesa con precisione 50 milligrammi di nanoparticelle di UIO 66 gerarchicamente porose preparate in una fiaschetta rotonda da fondo da 25 millilitri.

Aggiungi 10 millilitri di tetraidrofurano alla fiaschetta. Poi ultrasonicare la miscela per cinque minuti per disperdere completamente le particelle, ottenendo una sospensione opaca uniforme. Posiziona la fiaschetta a fondo rotondo in un bagno d'acqua ghiacciato su un agitatore magnetico impostato a 400 giri/min.

Usando una siringa di vetro, aggiungi 0,4 millilitri di nitrito tert butil goccia in cinque minuti, mantenendo la temperatura sotto i cinque gradi Celsius. Aggiungi immediatamente 0,35 millilitri di trimetil SL azide goccia a goccia nelle stesse condizioni di freddo. Può comparire una lieve effervescenza, indicando un progresso di nitrosazione.

Poi avvolgi il bagno d'acqua ghiacciato in carta stagnola di alluminio per proteggere la reazione dalla luce. Continua a mescolare la miscela di reazione nel bagno d'acqua ghiacciato per tutta la notte. Il giorno dopo, lava e asciuga il prodotto come mostrato.

Poi si utilizza la spettroscopia FTIR per verificare la trasformazione chimica. Trasferire cinque milligrammi di nanoparticelle azide UIO 66 gerarchicamente porose in un tubo centrifuga da due millilitri. Aggiungi 0,5 millilitri di buffer HEPES e sonica per due o cinque minuti.

Aggiungi 0,5 millilitri di buffer HEPES contenente 20 milligrammi per millilitro di emoglobina, e inverti delicatamente il tubo più volte per disperdere completamente le nanoparticelle. Ora posiziona il tubo su un termoshaker e incuba a temperatura ambiente, scuotendo a 1.000 giri/min per due ore. Dopo l'incubazione, centrifugare il tubo a 13.500 G per cinque minuti a temperatura ambiente, per pelletare le nanoparticelle di azide UIO 66, cariche gerarchicamente porose.

Poi raccogli con cura il soprannatante per quantificare l'emoglobina non intrappolata. Lava delicatamente il pellet tre volte con un millilitro di acqua ultrapura pipettando su e giù per rimuovere l'emoglobina assorbita in modo poco profondo. Poi raccogli con cura il soprandanzante di ogni lavaggio per quantificare l'emoglobina intrappolata.

Sospendere il pellet finale in 0,5 millilitri di acqua ultrapura e conservarlo in frigorifero prima della caratterizzazione. Utilizzare il saggio dell'emoglobina con solfato d'alloro per determinare l'emoglobina intrappolata nei supernanti raccolti. Pipetta 10 microlitri di ciascun soprantantante in una micropiastra da 96 pozzi.

Aggiungi 100 microlitri di solfato di alloro di sodio e incuba per cinque minuti a temperatura ambiente al buio. Utilizzando uno spettrofotometro visibile ultravioletto, misura l'assorbenza a 412 nanometri. Successivamente, preparare una diluizione seriale della scorta di emoglobina nel buffer HEPES per generare una curva standard.

Trasferire le diluizioni preparate nella piastra di 96 pozzi preparata per generare una curva standard per convertire le letture di assorbanza in concentrazioni di emoglobina. Trasferire 10 milligrammi delle nanoparticelle di azide UIO 66 caricate gerarchicamente porose in emoglobina in un tubo centrifuga da due millilitri contenente 0,5 millilitri di acqua ultrapura e sonicare per due a cinque minuti. Aggiungere 20 milligrammi di dibenzocicloottano, modificato con polietilenglicole per ottenere un rapporto equimolare tra polietilenico glicole e nanoparticelle.

Fai un vortice delicato sul tubo finché la miscela non è omogenea. Metti il tubo su un termoshaker e incuba a temperatura ambiente, scuotendo a 1.000 RPM per un'ora. Poi trasferisci il tubo in un frigorifero mantenuto a quattro gradi Celsius per una reazione notturna.

Centrifugare il tubo a 12.000 G per cinque minuti a temperatura ambiente per mettere in pellet le nanoparticelle UIO 66 modificate e caricate di emoglobina, caricate di emoglobina. Poi scarta il surnadante, contenente polietiilenico glicole non reattivo. Lavare il pellet tre volte con acqua ultrapura da due millilitri pipettando su e giù e centrifugando nelle stesse condizioni dimostrate in precedenza.

Risospendere le nanoparticelle di polietilenglicole UIO 66, cariche di emoglobina purificata, caricate gerarchicamente e porose, in due millilitri di acqua ultrapura. Conserva la sospensione a quattro gradi Celsius. Il colloide risultante appare omogeneo e leggermente opalescente, indicando una buona stabilità di dispersione.

Poi confermare la pegilazione riuscita tramite scattering dinamico della luce, o DLS. I gruppi amminodi di superficie sono stati convertiti con successo in azidi. Ciò è stato dimostrato dalla comparsa di una caratteristica azide asimmetrica, che si estende a 2.122 centimetri inversi nello spettro FTIR delle nanoparticelle azide UIO 66 gerarchicamente porose.

Questa banda era assente nelle nanoparticelle di ammina UIO 66 gerarchicamente porose. L'incapsulamento dell'emoglobina era visivamente indicato da un cambiamento di colore distinto dal giallo al rosso. L'assorbimento di azoto diminuì dopo il carico di emoglobina, indicando l'occupazione dei mesopori da parte delle molecole di emoglobina.

Il potenziale zeta delle nanoparticelle azide UIO 66, gerarchicamente porose, è diminuito da 42,9 millivolt a 20,4 millivolt dopo l'incapsulamento dell'emoglobina. La coniugazione riuscita del polietilenglicole è stata confermata dalla scomparsa delle vibrazioni di allungamento degli azidi a 2.122 centimetri inversi e dalla comparsa di segnali associati al polietilenglicole nello spettro FTIR. L'analisi DLS ha mostrato un aumento del diametro idrodinamico da circa 114,9 a 140,8 nanometri dopo la pegilazione, mantenendo comunque un basso PDI.

Questa particella consente la sintesi della nanoparticella morfometrica gerarchicamente porosa, l'incapsulamento dell'emoglobina, la peculazione superficiale e la valutazione della funzionalità di rilascio di ossigeno. Utilizzando questo protocollo, è possibile condurre ulteriore caratterizzazione fisico-chimica e studio funzionale, inclusa l'analisi del rilascio di ossigeno in vitro e della biocompatibilità delle nanoparticelle. Studi futuri potranno concentrarsi sulla preservazione della funzionalità dell'emoglobina per motivi più lunghi e indeterminati, come l'incorporazione di componenti per prevenire un degrado sostanziale.