Generazione e analisi trascriromica unicellulare degli organoidi del carcinoma epatocellulare dopo il trattamento farmacologico

Ci concentriamo su come gli organoidi dell'HCC rispondono al trattamento farmacologico e su come i loro studi traslazionali cambiano sul lavoro. Questo protocollo è utile per gli organoidi HCC e può essere adattato anche ad altri sistemi organoidi tumorali. Per cominciare, individuare organoidi derivati dal paziente da HCC o carcinoma epatocellulare e prepararli alla perturbazione terapeutica.

Prepara la soluzione di stock di lenvatinib in dimetilsolfosdo, o DMSO, secondo le istruzioni del produttore. Diluire la soluzione di base nel mezzo di coltura preriscaldata immediatamente prima dell'uso alla concentrazione di lavoro predefinita. Preparare una soluzione sufficiente per ottenere volumi finali uguali in tutti i pozzi, assicurando la stessa concentrazione di DMSO in ogni pozzo.

Successivamente, aggiungere un mezzo contenente lenvatinib a 20 micromolari lungo la parete di ogni pozzo per evitare di disturbare le cupole della matrice. Includere un controllo veicolo con la stessa concentrazione finale di DMSO. Incubare gli organoidi in condizioni di coltura standard per il periodo di trattamento predefinito.

Per trattamenti superiori a 72 ore, sostituire il mezzo contenente il farmaco ogni 48-72 ore, garantendo un programma di sostituzione coerente su tutti i pozzi. Registra immagini di base in campo chiaro prima del trattamento. Acquisire immagini a intervalli fissi durante il trattamento utilizzando le stesse impostazioni del microscopio, ingrandimento e posizioni di campo.

Per la valutazione morfologica della risposta al trattamento, si utilizzano impostazioni di esposizione, ingrandimento e soglie di analisi identiche per tutte le immagini. Misura la curva di crescita dell'area organoide calcolando l'area totale dell'organoide, per pozzo o campo, in ogni punto temporale, e normalizzando i valori alla linea di base. Per misurare il diametro medio dell'organoide, si determina il diametro dei singoli organoidi intatti e si calcola il valore medio per pozzo.

Successivamente, determina il conteggio degli organoidi sopravvissuti contando gli organoidi intatti morfologicamente identificabili, escludendo eventuali detriti o frammenti collassati. Eseguire un test tridimensionale di vitalità della luminescenza al punto finale del trattamento se è necessaria una valutazione aggiuntiva della vitalità globale seguendo le istruzioni del produttore. Poi, traccia le curve di crescita dell'area organoidale nel tempo.

Confrontare il diametro medio degli organoidi tra i gruppi trattati con veicoli e quelli trattati con lenvatinib. Inoltre, confronta i conteggi di organoidi sopravvissuti tra i gruppi di trattamento. Assicurarsi di utilizzare programmi di imaging coerenti, criteri di inclusione e parametri di analisi per garantire la riproducibilità.

Selezionare pozzi organoidi con morfologia 3D intatta, materiale sufficiente per la cattura di singole cellule e nessuna contaminazione visibile. Registra immagini in campo chiaro di ciascuna selezione molto prima della dissociazione utilizzando le stesse impostazioni del microscopio, ingrandimento e criteri di selezione del campo. Raccogliere organoidi in momenti temporali corrispondenti tra gruppi di controllo e trattati, mantenendo la stessa densità di placcatura, il programma di trattamento e le condizioni di sostituzione del mezzo in tutti i campioni.

Aspira completamente il mezzo di coltura da ogni pozzo. Lava ogni pozzo due volte con PBS ghiacciato per rimuovere il materiale residuo e i detriti. Aggiungi un millilitro di soluzione di recupero a cellule gelate in ciascun pozzo e incuba sul ghiaccio per 20-30 minuti.

Pipetta delicatamente ogni cinque-sette minuti durante l'incubazione per facilitare la dissoluzione della matrice. Trasferire il materiale disciolto in tubi pre-raffreddati utilizzando una punta a tubo largo o tagliata per ridurre al minimo lo stress da taglio del corpo. Si procede alla dissociazione enzimatica solo dopo che la matrice è in gran parte disciolta e rimane un residuo di gel visibile minimo.

Centrifugare la sospensione organoide recuperata a 300 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovi il sovrantante con cura senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet in un millilitro di enzima di dissociazione cellulare ricombinante e incubare a 37 gradi Celsius per cinque-dieci minuti.

Pipetta delicatamente otto o dieci volte ogni due-tre minuti, usando una punta P1000 a cane larga, per favorire la dissociazione. Si interrompe la digestione quando la maggior parte dei frammenti organoidi si è dispersa in singole cellule e rimangono solo piccoli gruppi residui. Successivamente, aggiungi quattro millilitri di PBS ghiacciato contenente il 2% di siero bovino fetale per fermare la digestione.

Poi, filtra la sospensione attraverso un colino a celle da 40 micrometri. Lava una volta con PBS per rimuovere enzimi residui, aggregati e detriti. Conta le cellule usando l'esclusione del blu di tripano.

Dopo aver assicurato la vitalità cellulare dell'85% o superiore, si aggiutica la concentrazione cellulare finale da 700 a 1.200 cellule per microlitro. Escludere campioni con detriti eccessivanti, cellule morte abbondanti, grandi aggregati visibili o dissociazione incompleta. Ripeti la filtrazione prima del caricamento se sono presenti aggregati.

Controllo del processo e campioni trattati in condizioni identiche, inclusi l'enzima di dissociazione, il tempo di digestione, la frequenza di pipettare, il metodo di filtrazione, la concentrazione cellulare e la strategia di carico. Infine, dopo l'amplificazione della libreria a singola cella, eseguire il sequenziamento a singola cella. L'organoide sopravvisse ed esplose sotto condizioni standard di coltura tridimensionale dal primo al sesto giorno dopo il recupero.

Al primo giorno, gli organoidi apparivano come piccole strutture compatte, mentre al sesto giorno mostravano dimensioni aumentate e una morfologia ben definita. Gli organoidi trattati con lenvatinib erano più piccoli e mostravano una morfologia alterata rispetto ai controlli trattati con DMSO. L'analisi quantitativa ha mostrato una riduzione del diametro medio degli organoidi dopo il trattamento con lenvatinib, rispetto ai controlli DMSO.

Questo protocollo ci permette di studiare i cambiamenti nello stato cellulare, nella composizione cellulare e nell'espressione genica dopo il trattamento. La sfida più grande è preservare la vitalità delle cellule, mantenendo un processo semplice coerente in tutti i gruppi. L'analisi cellulare a valle può essere condotta seguendo questa procedura, inclusi clustering, analisi di esperimenti genici differenziali, analisi dell'arricchimento delle vie e inferenza del tesoro.