タンデム質量分析法における関心の生体分子は生体試料から分離され、その組成とシーケンスを明らかにするために複数のサブユニットに断片化されました。これは、シリーズの質量分析装置を持っていることで。最初の分光計は、特定質量比を充電するためのサンプルとフィルター イオンをイオン化します。フィルター処理されたイオンは断片化し、フラグメントの分析、2 つ目の質量分析計に渡されます。
このビデオは、質量比の選択と解離のメソッドを含むタンデム質量分析法の原則を紹介します。また生化学的化合物を分析するための一般的な手順で使用しているタンデム質量分析法による衝突誘起解離。アプリケーションでは、監視、タンパク質翻訳後修飾の定量およびタクロリムス血中濃度の検出選択反応を説明します。
タンデム質量分析のリンクが最初に質量分析の複数の段階、生体分子を分離、化学構造の側面を確認して一緒に。生体は、その分子の組成を決定し難い大規模で複雑な構造を持ちます。タンデム質量分析は、後で識別・ シーケンスを明らかに助けることができる複数のサブユニットに断片化している興味の分子を選択します。このビデオでは、生化学のタンデム質量分析法の概念、一般的な手順とその利用方法のいくつかが表示されます。
典型的な仕様質量計測器としてタンデム質量分析を開始: イオン源、イオン、および質量分析器にサンプルを変換するとイオンの質量電荷比に基づいて分離します。他は装置の棒に衝突しながら、共通の質量分析器、四重極は、特定の割合でイオンをのみ使用できます。認められれば、種前駆イオンと呼ばれる興味の生体分子であります。イオンに衝突セル、通常別の四重極、フラグメントを予測可能なパターンでイオンにエネルギーを適用する場所に移動します。
これらのフラグメントは、飛行時間型のこれら「プロダクト イオンを分けるなど、別の質量分析器に移動します。製品イオン、通常 MS の器械のように、検出器に送られます。未知の蛋白質の場合は、結果として得られるスペクトルには生体の決定的な完全なシーケンスを生成困難多数の重複フラグメントが含まれています。しかし、スペクトルのパターンは、特定の蛋白質に一意です。解析ソフトウェアは、重複フラグメントから未知の蛋白質を解明、知られているペプチド配列のデータベースへのスペクトルを比較します。
サンプルと断片化の所望の程度に応じて複数の断片化方式が可能です。断片化のパターンは、エネルギーを転送する方法、その量と前駆イオンを配布する方法に依存します。エネルギーは、中性粒子や放射線、電子を介して転送することができます。主にそれらの識別に最適なアミノ酸間のペプチド結合の切断中性原子、衝突誘起解離または CID と呼ばれるプロセスを使用しています。
今では技術の基礎をカバーしている、細菌の細胞の封筒のコンポーネントを研究に使用されている CID タンデム質量分析法を見てみましょう。
すべての質量分析実験と同様、最初の手順は、サンプルをイオン化するためです。生体分子、マトリックス支援レーザー脱離エレクトロ スプレー イオン化とこれは通常です。前駆物質イオン信号は、イオン光学系のチューニングによって、最適化されます。ターゲットが分離されれば、および断片化メソッドを選択すると、CID など。
衝突のセルに前駆イオンを加速する、電圧印加の強さは、断片化の程度を影響します。前駆体がほぼ最高製品イオンと比較して 10% 豊富になるまで、この電圧が増加します。複数スペクトルが取得され、十分な信号対雑音比を達成するまでの平均します。必要スキャン数は元の前駆イオンの信号強度に依存して、3 から 300 までの範囲をすることができます。
この例では、エシェリヒア属大腸菌 K-12 から脂質 A の検体は、CID 後 19 主なフラグメントを持っていた。リピド A の構造はよく知られている、サンプルから特定の構成を再構築するためのソフトウェアを許可します。
今では手順を見てきた、いくつかの生化学のタンデム質量分析法を使用する方法を見てみましょう。
タンデム質量分析法における一般的なスキャン モードは選択した反応の監視、または SRM です。SRM では、両方の質量分析装置は、前駆体および製品、特定のイオンに焦点を当て、選択した質量電荷比に固定されます。SRM の感度の高いのためペプチド濃度既知の標準スペクトルを利用し、定量化する興味の蛋白質をできるように、未知のサンプルを比較できます。、
タンパク質一般官能基のメチル基、リン酸基、糖鎖と呼ばれる糖などの添加により通常翻訳後変更されます。これらは細胞シグナリング プロセス、細胞が互いに通信する方法の解明に重要です。タンデム質量分析法より小さいコンポーネントに蛋白質をフラグメント化、ため特定のフラグメントまたはアミノ酸も PTM の位置を特定することが可能です。アセチル化とトリメチルなどのいくつかの変更は、クロマト グラフ分離は、質量分析の前に行われるだけで、質量を区別することは困難。
患者の血液で多くの検体は、典型的な質量分析法の検出限界以下の濃度で発見されます。SRM の別の利点は、すべてが 1 つの製品のイオン、感度、検出下限値を最大 100 倍に強化を破棄です。この例では、タクロリムス、免疫抑制薬は、1 ng/mL のレベルで検出できます。
タンデム質量分析法でゼウスのビデオを見てきただけ。このビデオ計測器の理論を説明した、一般的な手順行き、手法が現在使用されている方法のいくつかを説明しました。見てくれてありがとう!
タンデム質量分析は、質量分析の複数の段階をリンクして、最初に生体分子を分離し、次にその化学組成の側面を決定します。生体分子は大きく複雑な構造を持っているため、その分子組成を決定することは困難です。タンデム質量分析は、目的の分子を選択し、後で複数のサブユニットに断片化することで、その同定と配列の解明に役立ちます。このビデオでは、タンデム質量分析の概念、一般的な手順、および生化学におけるその使用の一部を示します。
タンデム質量分析は、サンプルをイオンに変換するイオン源と、イオンを質量電荷比に基づいて分離する質量分析器を備えた典型的な質量分析装置として始まります。一般的な質量分析器である四重極は、特定の比率のイオンのみを通過させますが、他のイオンは装置のロッドに衝突します。通過を許された分子種は、プリカーサーイオンと呼ばれ、目的の生体分子です。イオンはコリジョンセル(通常は別の四重極)に移動し、そこでエネルギーが印加されて予測可能なパターンでイオンが断片化されます。
これらのフラグメントは、Time-of-Flightなどの別の質量分析器に移動し、これらの「プロダクトイオン」を分離します。その後、プロダクトイオンは、通常のMS装置と同様に検出器に送られます。未知のタンパク質の場合、得られるスペクトルには多数の重なり合うフラグメントが含まれているため、生体分子の決定的な完全な配列を生成することが困難になります。ただし、スペクトルパターンは特定のタンパク質に対して一意です。解析ソフトウェアは、スペクトルを既知のペプチド配列のデータベースと比較し、オーバーラップするフラグメントから未知のタンパク質を解明します。
サンプルと必要なフラグメンテーションの程度に応じて、複数のフラグメンテーション方法が可能です。フラグメンテーションパターンは、エネルギーの移動方法、その量、およびプリカーサーイオンを介したエネルギーの分布方法によって異なります。エネルギーは、中性粒子、放射線、または電子を介して伝達できます。中性原子を用いることで、衝突誘起解離(CID)と呼ばれるプロセスは、主にアミノ酸間のペプチド結合で切断され、アミノ酸の同定に理想的です。
この手法の基本がわかったところで、細菌細胞エンベロープの成分を研究するために使用されているCIDタンデム質量分析を見てみましょう。
すべての質量分析実験と同様に、最初のステップはサンプルをイオン化することです。生体分子の場合、これは通常、マトリックス支援レーザー脱離またはエレクトロスプレーイオン化によって行われます。次に、イオン光学系のチューニングにより、プリカーサーイオンシグナルが最適化されます。完了すると、ターゲットが分離され、CIDなどのフラグメンテーション方法が選択されます。
プリカーサーイオンをコリジョンセルに加速する印加電圧の強度は、フラグメンテーションの程度に影響します。この電圧は、前駆体が最高生成物イオンと比較して約10%の存在量になるまで増加します。複数のスペクトルが取得され、十分なS/N比が達成されるまで平均化されます。必要なスキャン回数は、元のプリカーサーイオンのシグナル強度に依存し、3〜300の範囲です。
この例の分析種は、大腸菌K-12由来の脂質Aで、CID後に19の主要なフラグメントがありました。脂質Aの一般的な構造はよく知られているため、ソフトウェアはサンプルから特定の組成を再構築できます。
手順を見てきたところで、生化学におけるタンデム質量分析の使用方法をいくつか見てみましょう。
タンデム質量分析の一般的なスキャンモードは、選択反応モニタリング(SRM)です。SRMでは、両方の質量分析計が選択した質量電荷比に固定され、特定のプリカーサーイオンと製品イオンに焦点を当てています。SRMは感度が高いため、既知の濃度のペプチドスタンダードのスペクトルを利用して、未知のサンプルのスペクトルと比較することで、目的のタンパク質を定量することができます。
タンパク質は、通常、メチル基、リン酸基、糖などの官能基(グリカン)の付加によって、翻訳後に修飾されます。これらは細胞シグナル伝達プロセスにおいて重要であり、細胞が互いにどのように通信するかを解明します。タンデム質量分析はタンパク質をより小さな成分に断片化するため、PTMが特定のフラグメントやアミノ酸に位置を特定することができます。アセチル化やトリメチル化などの一部の修飾は、質量だけでは区別が難しいため、質量分析の前にクロマトグラフィー分離を行います。
患者の血液中の多くの分析種は、一般的な質量分析の検出限界を下回る濃度で検出されます。SRMのもう一つの利点は、1つの製品イオンを除くすべての製品イオンを破棄し、感度を向上させ、検出下限を最大100倍に向上させることです。この例では、免疫抑制剤であるタクロリムスを 1 ng/mL のレベルで検出できます。
JoVEのタンデム質量分析に関するビデオをご覧になりました。このビデオでは、機器の理論を説明し、一般的な手順を説明し、現在この技術がどのように利用されているかを説明しました。ご覧いただきありがとうございます!
Chapters in this video
0:00
Overview
0:54
Principles of Tandem Mass Spectrometry
3:23
Instrumental Operation
4:48
Applications
6:49
Summary
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