個々のシナプス前終末でのドーパミン放出はFFNsと可視化

サマリー

光学的に蛍光ドーパミンの類似体を用いて神経伝達を測定するための新しい手段。

要約

神経系は、シナプス小胞融合の間に神経伝達物質の放出を介してニューロン間の信号を送信する。直接個々のシナプス前終末から神経伝達物質の取り込みと放出を観察するために、我々は、シナプス小胞モノアミントランスポーターの基質として蛍光偽の神経伝達物質を設計した。線条体での画像のドーパミンの放出にこれらのプローブを使用して、我々は、シナプス可塑性に関連するいくつかの観測を行った。我々は、刺激ごとに神経伝達物質を放出するシナプス小胞の割合は、刺激周波数に依存していたことがわかった。動力学的に別個の"リザーブ"シナプス小胞の人口は、これらの実験条件下で観察されなかった。シナプス前終末の周波数に依存する不均一性は、シナプス前選択の周波数に依存するコーディングのためのメカニズムを示し、D2ドーパミン受容体に部分的に依存していたことが明らかになった。

ホイ張とNiko G.のGubernatorはこの作品にも同様に貢献しています。

プロトコル

このメソッドは、で報告された研究で使用されてGubernator ら、Science 324（5933）。 1441-1444（2009） 。

1。急性線条体スライスの準備

1. 急性線条体スライスを準備する前に、一つは酸素を人工脳脊髄液（ASCF）と前脳の抽出には少なくとも15分間氷でそれを冷やし必要があります。 ACSFの氷冷を維持し、解剖時の酸素。 ACSF（mMで）：NaClの125、KClを2.5、NaHCO _3の 26のCaCl ₂ 2.4、硫酸マグネシウム1.3、KH ₂ PO ₄ 0.3、グルコース10、HEPES 5、pHが7.3から7.4、290から295 mOsm。
2. 麻酔なしで雄マウスを刎ねる。
3. マウスから脳全体を抽出し、そしてクレイジー®接着剤を使用してビブラトーム上に配置ビブラトームトレイにマウントします。脳の抽出と取り付けは2分以内に行う必要があります。この時間の間に、ACSFの氷冷を維持し、組織の健康を保つために酸素をしてください。
4. ブレグマ1.54の間に0.62 ^1〜250μmの厚さで冠状線条体の脳切片をカット。三全体のスライスは、針6の半分のスライスにカットすることができますが得られます。
5. プローブ負荷の前に少なくとも1時間室温で酸素化されたACSFの脳切片をインキュベートします。スライスは良いFFN511ローディングを表示し、スライスの調製後4時間まで撮影のためにアクティブのまま。

2。ローディングFFN511

1. FFN511ローディング液（ACSFで10μMFFN511）を準備し、また、ACSFで100μMADVASEP - 7を準備する。すべてのソリューションを新たに調製し、スライスにロードするために少なくとも15分前に酸素化されるべきである。
2. 個別に室温で30分間FFN511ローディングソリューションでスライスをインキュベートする。
3. その後、室温²で30分間酸素100μMADVASEP - 7 ACSFでロードされたスライスをインキュベートすることにより、細胞外組織に結合した色素を取り除く。スライスは、現在のイメージングのための準備が整いました。

3。脳スライスのイメージングFFN511

スライスのFFN511のイメージングは​​、多光子レーザー走査型顕微鏡を用いて行われる。我々は（我々は以前にツァイスLSM 510 NLO多光子レーザー走査型顕微鏡を使用していたし、いくつかの結果はツァイスの顕微鏡で得られた）プレーリーウルティマ多光子レーザー走査顕微鏡を使用しています。

1. 録音室でFFN511負荷スライス（RC - 27L、ワーナー）を配置し、分あたり1-2 mlの流量で酸素化されたACSFで表面かん流する。その後、実験時の動きを最小限に抑えるために、スライスの上にナイロン弦とプラチナのハープを置きます。さらなる動きを最小限に抑えるために、スライスは、イメージングの前にチャンバー内で少なくとも10分間安定化させることができます。
2. 視覚化し、10倍の水浸対物レンズの下で明視野発光と背側線条体を探します。
3. この地域の場所や位置バイポーラツイストタングステン電極刺激実験を行う場合。理想的な撮像領域を刺激バイポーラ電極の2つのヒントの間に300μmの内に位置しています。視野の中心にこの地域を置きます。
4. 63x（0.9 NA）水浸紫外線の目標の下に画像FFN511標識線条体の端末。 FFN511はスペクトル物理学と線条体端末の最適な蛍光からマイタイのレーザーと760 nmで励起され、バンドパスフィルタ（480〜520 nm）を介して見られている。画像は512 × 512ピクセルの解像度での関心の75 × 75μmの領域と12ビット形式でキャプチャされています。刺激脱色実験については、z平面上の1μm以下で区切られたz軸のシフト、5-7画像のz -シリーズ、、を補正するためには、各期間に取得されます。

4。 FFN511脱色

FFN511ラベルは、KClの高濃度（我々は70 mMのKClを使用）、（+）-アンフェタミン硫酸（AMPH、20μM）、または電気刺激によりいずれかを脱色することができます。における高カリウムのACSF液を脳のスライスに適用される塩化カリウム、脱色実験、、2分以内にFFN511ラベルdestains。レコードには、XYZ - Tの画像を時間をかけてFFN511脱色を追跡する。以下では、電気刺激に依存するドーパミン端末脱色について説明します。

1. 時間をかけてFFN511脱色を追跡するために、XYZ - Tの画像が記録されます。スライスの最小限の動きを（z軸に4μm未満）を確実にしていないレーザーによる退色、Zスタックの制御の時系列画像は、刺激前に少なくとも5分間取得する必要があります。そうでなければ、レーザーパワーを調整する。
2. 1、4または20 Hzの周波数で刺激を開始しながら、これらのコントロールのイメージに続いて、XYZ - Tのイメージングを続ける。 1、4または20 Hz（300μ× 1 mA）を少なくとも刺激は双極電極を使用してマスター- 8パルスジェネレータ（AMPI、エルサレム、イスラエル）によって引き起こされるアイソフレックスの刺激アイソレータによって局所的に線条体に適用されます。最小限にリリースサイトの脱分極の変化は、我々は、サイクリックボルタンメトリーによって決定される最大刺激強度の150％を適用し刺激プロトコルを使用している。
3. 画像解析のための適切なソフトウェアを使用してください。私たちの研究室では、我々は、時間3で涙点蛍光と変化を定量化するためにイメージJ（ウェインRosband、国立衛生研究所、ロックビル、MD）とIDLのカスタムで作成されたソフトウェア（リサーチシステムズ、ボルダー、CO）を使用します。

Represenative結果

図1は、線条体スライスにFFN511読み込みが完了であることを示しています。 10倍と60倍対物レンズを用いて代表的なイメージは、図1に示されています。ドーパミン端末の選択的標識は、20μMのアンフェタミンによって脱色することができます。
図2は、高塩化カリウムによってFFN511ラベリングの脱色を示しています。
図3は、地元の電気刺激によってFFN511ラベリングの脱色を示しています。

1 FFN511ラベルライブ皮質-線条体急性スライス内のドーパミンの端子図急性ライブ皮質-線条体スライスのFFN511によって（）ラベル：。線条体に豊富なラベリング（STR）、皮質（CTX）におけるスパースなラベリング、およびでないラベル脳梁（CC）。スケールバー：100μmのアンフェタミンによる線条体からFFN511の（B）脱色。。左のパネル：アンフェタミンの前に、右のパネル：20μMのアンフェタミンの20分後。スケールバー：10μmである。

図2。高KClをしてFFN511ラベルの脱色。 FFN511標識はACSFで70 mMのKClの2分間のアプリケーション内で脱色されています。スケールバー：10μmの。

図3：周波数依存性の線条体におけるFFN511ラベルの脱色。（）4 Hzで局所刺激は端末からの脱色となりました。刺激は、t = 0で始まった。スケールバー：5μmの（B）4 HzでFFN511の脱色は、Ca ^{2 +} -及び周波数に依存する。。コントロールにはない刺激（3スライスから153涙点）を受信しません。塩化カドミウム（200μM）で脱色すると非刺激対照（5スライスから475涙点）と同一であった。各刺激の周波数のための脱色曲線は単一指数減衰関数と半減期により適合させた（T _{1 / 2）τX} 0.693（1 Hzと計算値：9スライスから765涙点、4 Hzの7のスライスから410涙点、 20 Hzの：6スライスから416涙点）。線条体の脳のスライス標本におけるエキソサイトーシスの間にFFN511脱色の2光子顕微鏡からのビデオ顕微鏡写真を参照してください。

ディスカッション

このビデオでは、我々は光学的に蛍光ドーパミンの類似体を用いて神経伝達を可視化する方法を示しています。 FFN511は、我々が開発したFFNsの第1世代です。それは、科学に示すように（皮質のシナプス小胞に細胞質からモノアミン神経伝達物質を運ぶ神経細胞の小胞モノアミントランスポーター（VMAT2）、そして特にラベル線条体におけるドーパミンの端末と推定されるカテコールアミンおよび/またはセロトニンの端末をターゲットにして設計されましたが、紙）FFN511は比較的疎水性であるため、適切なローディング期間は特異性のための非常に重要です。我々はその40分より長くするためのインキュベーションは、線条体切片における豊富な非特異的染色をもたらす発見。特異性は、素直に機能的なシナプス小胞内にFFNの放出を引き起こすはずKClの高濃度を、使用して脱色によって決定することができる。 15分未満のためFFN511へのスライスの曝露は、端末の染料の不十分な負荷に起因する微弱な蛍光シグナルになります。このプロトコルでは、我々は細胞外組織に結合した色素を除去するために100μMADVASEP - 7を使用してください。この手順は必要ありませんが、それが省略された場合、ACSFで洗い流し時間は延長する必要があります。要約すると、選択した準備に応じて、最適なラベルを決定するために濃度およびローディング期間を変更する必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one)	コロンビア大学 - Dalibor Sames研究室
ADVASEP-7	CyDex	AR-OA7-005
RC-27L 記録室	Warner Instruments	64-0375
PELCO PrepEze 6ウェルホルダー	Ted Pella, Inc.	36157-1	スライス培養用
Master-8 パルス刺激装置および Iso- Flex 刺激アイソレーター	AMPI