Name: ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-07T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ胚へのマイクロインジェクション技術。mRNA過剰発現とモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドによる遺伝子ノックダウンを実施し、発生生物学における遺伝子機能の理解を深める方法です。

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この作品は、ZSにNIHとPKD財団によってサポートされていました。全ての動物実験は、イェール大学動物資源センター（YARC）と動物実験の使用委員会（IACUC）のガイドラインに従って行った。

パート1：マイクロピペットの準備、およびマイクロインジェクションチャンバープレート<ol><li>加熱とマイクロピペットプラー装置でホウケイ酸ガラス毛細管（世界プレシジョンインスツルメンツ社、1B100 - 4）を引いて（サッターインスツル株式会社、フレーミング/ブラウンP - 97）でマイクロピペットを作製。粘土や粘着テープの少量の上にペトリ皿に保管してください。 </li><li>注入中に胚を保持するための簡単な方法（&quot;ゼブラブック&quot;で説明したように）となるくさび形トラフで成形された1 × E3培地プレートに1.5％アガロース（アメリカンBioanlytical、（株）、AB00972 - 00500）を注ぐ（1）寒天チャンバープレートは4℃で使用してストアする前に固化してみましょう</li></ol>パート2：RNAの調製遺伝子機能研究のための一つの強力なアプローチは、ゼブラフィッシュ胚のin vitro転写されたキャップRNA に微量注射することです。キャップRNAは、CAPのアナログの存在のために生体内で見られる真核生物のmRNAと同じように振る舞います。ゼブラフィッシュ研究者が日常的に興味のある遺伝子を過剰発現またはmisexpressにこのメソッドを使用しています。このデモでは、EGFP -タグ付き写しを顕微注入するだろうし、成功した注射のための可視読み出しとしてライブ全体の胚のGFP -式を使用します。 <ol><li>興味のある成績証明書に関する in vitro CAP RNAの転写反応で行います。私たちの研究室では、我々は日常的にpCS2 +ベクターに目的のcDNAを挿入し、mMessage mMachine SP6キット（Ambion社、（株）、AM1340）を用いてキャップRNAの大量の in vitro合成反応で行います。 </li><li> RNeasyミニキット（キアゲン社、74104）を介して実行するか、またはフェノールによるRNAサンプルを浄化：クロロホルム抽出およびイソプロパノール沈殿。 </li><li>慎重に使用するための準備ができるまで-80℃でRNA調製とストアの濃度を決定する。 </li><li>注射の日に、RNAサンプルを解凍、軽くボルテックスし、手短にスピンダウン。 </li><li> 0.050パーセントフェノールレッド（シグマ - アルドリッチ社、P0290） - 滅菌水と0.025の最終濃度で希釈標準溶液を準備します。フェノールレッドは、胚への溶液の注入のための可視マーカーとして機能します。この記事では、我々は0.050％フェノールレッドでは100 ng / uLのEGFPのmRNAの希釈標準溶液を準備します。 </li><li> -80℃に氷とリターンRNAの株式の実際のサンプルを続ける</li><li>ときにこのサンプルを注入する準備ができてパート4に進みます。 </li></ol>パート3：モルホリノの準備モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを広く対象となるタンパク質の翻訳をブロックすることにより、またはpre - mRNAのスプライシング2,3を変更することによって遺伝子発現を変更するために使用されます。ゼブラフィッシュのモルフォは、遺伝子機能をノックダウンにより、強力な逆遺伝学のツールと​​して機能します。この記事では、PKD2の翻訳開始部位（5&#39; - AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC - 3&#39;）をターゲットにモルホリノオリゴを顕微注入するでしょう。以前に確立された作業に基づいて、我々は、注入された胚の表現型PKD2変異魚4を模倣することを期待しています。 <ol><li>我々は日常的に特にジーンツールから目的の遺伝子、LLC（フィロマス、OR）のために設計されたモルホリノオリゴの300 nmolのを注文。 </li><li> 3mMのストック溶液を作るために100μLの滅菌水を追加。使用直前まで-20℃で分注しソリューションとストア。 </li><li>注射の日に、65℃モルホリノソリューションを加熱し5分間° C。直ちに氷上で冷却パチンと簡単にスピン。このステップでは、オリゴ内の任意の二次構造を変性し、溶液を完全に可溶化されることが保証されます。 </li><li> 0.050パーセントフェノールレッド - 滅菌水と0.025の最終濃度でモルホリノ溶液を希釈することにより、ワーキング溶液を調製。このデモでは、我々は0.050％フェノールレッドで0.50 mmのPKD2モルホリノのワーキング溶液を調製する。 </li><li>室温でソリューションを働き続ける。 </li><li>ときにこのサンプルを注入する準備ができてパート4に進みます.---- </li></ol>パート4：正常に機能するソリューションとマイクロピペットを充填<ol><li>鉗子または50倍の倍率で解剖顕微鏡（ニコンインスツルメンツ社、SM2645）の下に見えるように開口部を作成するために外科的黒人とマイクロピペットの先端チップをカット。 </li><li>カバースリップ上にドロップなどの作業溶液2 ULを置きます。 </li><li>皮下注射針と少し浸しワーキング溶液がドロップにマイクロピペットの先端チップを上にチューブを装着した5 mLの注射器にマイクロピペットの背面に取り付けます。マイクロピペットの先端を破損しないように注意してください。 </li><li>シリンジのプランジャーを引いて、マイクロピペットの先端を通して実用的なソリューションをサイフォン。 </li></ol>パート5：マイクロピペットの注入量のキャリブレーション<ol><li>マイクロメータのスライド上にミネラルオイルを一滴（アメリカンバイオアナリティカル社、AB00921 - 00025）（Fiを置きますシェール、12 - 561 - SM1）。 </li><li>圧力パルスマイクロインジェクター装置（世界プレシジョンインスツル株式会社、PV830）の電源とエアの供給をオンにします。 </li><li>マイクロインジェクタの装置のマイクロピペットホルダーにマイクロピペットを取り付けます。マイクロインジェクタは、圧力調節と放電がフットペダルを押すことによって活性化されています。 </li><li>解剖顕微鏡下で、マイクロメートルの油の上に、作業溶液の液滴を配置するマイクロインジェクターを使用して注入量をテストします。それはオイルの上に球のようにfloatとしてドロップの直径を測定する。 </li><li>持続時間と慎重に注入してボリュームを校正するために注射の圧力を調整します。このステップでは、マイクロインジェクションの実験の再現性にも役立ちます。このデモでは、すべてのmicroinjectionsは0.15ミリ（体積で約1.76 NL）の液滴直径で行われます。 </li><li>あなたの注入量が校正された後、埋め戻しとマイクロピペットの漏洩を防ぐために、マイクロインジェクターの&quot;ホールド&quot;ノブを使用してください。 </li></ol>第6部：マイクロインジェクションのための準備受精ゼブラフィッシュの胚<ol><li>ゼブラフィッシュは、ランダムに毎朝の最初の数時間でかん合します。 1セルの段階で胚を収集し、1X E3培地に置いてください。 </li><li> 3mLの転送ピペット（ベクトンディッキンソン実験器具、357524）を使用して、マイクロインジェクションチャンバープレートのくさび形の谷に沿って胚を手配する。 </li><li>胚が浅く水没し、浸水されないようにメディアを取り外します。このステップでは、同様にマイクロピペットで絨毛膜の浸透のように谷の底部に胚の解決に役立ちます。 </li></ol>パート7：絨毛膜を介してマイクロインジェクション<ol><li> 1細胞期胚の細胞質は解剖顕微鏡下で見えるようにマイクロピペットで胚を操作する。マイクロピペットの先端を破損しないように注意してください。 </li><li>胚に注入するために、絨毛膜し、マイクロピペットと卵黄を貫通する。このデモでは、我々はまず最初に、直接セルの下に卵黄にマイクロインジェクションし、細胞内に実用的なソリューションをもたらすために細胞質の流れと拡散を許​​可されます。この流れは、ワーキング溶液に添加し、フェノールレッドによる可視です。 </li><li>我々はまた、細胞の細胞質に直接注入のデモンストレーションを行います。適切な胚の向きとマイクロインジェクション技術が要求されるようにセルに直接マイクロインジェクションは、より堅牢なだけ時間がかかります。細胞膜は、卵黄の膜よりも厳格であるとして、それは細胞の細胞質に到達するための卵黄を介してマイクロピペットを入力することが多い高速です。トラフの底部に向かって動物極の向きや安定した手での作業は、注入のこの方法で助けることができる。 </li><li>マイクロインジェクションした後、E3培地とシャーレに胚を置いて、28.5でそれらをインキュベート° Cの正常な発達のために。 </li><li>胚発生の次の数時間、数日にわたって、目的の表現型の胚を観察。 </li></ol>パート8：代表的な結果 EGFPのmRNAの過剰発現：マイクロインジェクションの成功を確認するには、我々 は 、in vivo全胚蛍光顕微鏡（ライカマイクロシステムズ社、MZFLIII） のことでシールドのステージ（〜6 HPF）で始まる胚におけるGFPの発現を監視します。構築物の発現は、胚発生の初期の事象の間に最も強く、注入キャップRNAが徐々に低下し、発現タンパク質の安定性に依存するため、多くの場合、開発中に低下します。 PKD2モルホリノを翻訳ブロッキング： - 3 DPF 4以前に公表された結果に基づき、我々は約2でPKD2変異ゼブラフィッシュと現在の腎臓の嚢胞に見られるように背側体軸の曲率を模倣するPKD2 morphantsを期待する。 <img src="/files/ftp_upload/1113/1113fig1.png" alt="図1" /> 図1：EGFP mRNAおよびPKD2 AUGモルホリノのマイクロインジェクションから代表的な結果。 （A）TABの胚は、EGFPのmRNAの0.17 ngで、1細胞期にマイクロインジェクションし、in vivoで GFPの発現で 1 DPFで可視化した。 （B、C）TABの胚は0.50 mMでPKD2翻訳ブロッキングモルホリノの約1.7 NLで、1セルの段階でマイクロインジェクションし、4 DPFで背側の体の曲率のためにスコア化した。

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<li>Murphey, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+screening+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small molecule screening in the zebrafish.</a> Methods. 39, 255-261 (2006).</li>
</ol>

ゼブラフィッシュ胚に微量注入は開発中の特定の遺伝子の役割を探索するための十分に確立し、堅牢なテクニックです。アプリケーションでは、過剰発現、misexpression、および目的の遺伝子だけでなく、複数の遺伝子間のエピスタシスの解析のノックダウンアッセイが含まれています。ゼブラフィッシュのマイクロインジェクションは広くトランスジェニック動物の生成、および初期の胞胚胚5,6,7,8,9で細胞の運命をマッピングするために使用されています。さらに、この手法の応用は、細胞移植の方法10で生殖系列キメラを生成する上で重要なステップとなります。 遺伝子の&quot;機能獲得型&quot;の表現型を探索するための一つの代替方法は、その遺伝子の構成的活性型を顕微注入することです。さらに、遺伝子の擬似&quot;機能喪失&quot;表現型は、その遺伝子のドミナントネガティブ型のマイクロインジェクションによって検討されることがあります。ゼブラフィッシュ胚へのマイクロインジェクションは、DNAや低分子化合物11,12を含めること...

他のすべての材料は、プロトコルに記載されています。

ゼブラフィッシュ胚におけるmrnaおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

開発中に遺伝子の役割を調査するための不可欠なツールには、遺伝子ノックダウン、過剰発現、およびmisexpressionの研究を実行する機能です。ゼブラフィッシュの（<em&gt;ゼブラフィッシュ</em&gt;）、胚にRNA、DNA、タンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび他の小分子のマイクロインジェクションは、研究者に遺伝子機能を探索するための迅速かつ堅牢なアッセイを提供する<em&gt; in vivoで</em&gt;。このビデオの記事では、我々は準備して顕微注入する方法を紹介します<em&gt; in vitroで</em&gt;合成されたEGFPのmRNAと翻訳ノンブロッキングモルホリノオリゴに対する<em&gt; PKD2</em&gt;、1細胞期のゼブラフィッシュの胚への常染色体優性多発性嚢胞腎疾患（ADPKD）、に関連する遺伝子。私たちは、その後、GFPの発現と表現型の解析を検証することによってmRNAおよびモルホリノmicroinjectionsの成功を分析する。この技術の広範なアプリケーションが生成するトランスジェニック動物および生殖系列キメラ、細胞運命のマッピングおよび遺伝子のスクリーニングが含まれています。ここに我々は、EGFPとノックダウンのの過剰発現のためのプロトコルを記述する<em&gt; PKD2</em&gt; mRNAとモルフォリノオリゴヌクレオチドを​​注入して。

マイクロインジェクションは受精ゼブラフィッシュの胚への外来物質を導入するための十分に確立し、効果的な方法です。ここで、我々は、ゼブラフィッシュでのmRNAの過剰発現、およびモルフォリノオリゴヌクレオチドの遺伝子のノックダウンの研究を行うための堅牢なマイクロインジェクション法を示しています。

ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

発生過程における遺伝子の役割を研究するための不可欠なツールは、遺伝子のノックダウン、過剰発現、および異所性発現を行う能力である...

この手順では、まずモルフォリノおよびin vitro転写したキャップ付きmRNAを調製します。マイクロピペットにモルフォリノ含有溶液を吸引して満たし、マイクロメーター付きの一細胞ステージを用いて注入量を校正します。その後、ゼブラフィッシュの胚を回収し、卵黄へのマイクロインジェクションのためにマイクロインジェクションチャンバーに配置します。作製した作動溶液を細胞の直下の卵黄に注入し、細胞質流を利用して溶液を細胞微量注入部位まで運搬させます。続いて、溶液を細胞質内に注入します。胚をE3培地中で28.5 °Cでインキュベートし、その後の段階で目的の表現型を確認します。こんにちは。私はイェール大学医学部遺伝学部門、Dr. Sashaの研究室で研究を行っておりますShiloh Yuenです。本日は、ゼブラフィッシュにおけるmRNAの過剰発現およびモルフォリノオリゴヌクレオチドを用いた遺伝子ノックダウン研究を行うための、堅牢なマイクロインジェクション技術について解説します。私たちの研究室では、嚢胞性腎疾患における一次繊毛の役割を研究するためにこの手法を用いています。それでは始めていきましょう。遺伝子機能研究における強力なアプローチの一つに、in vitro 転写されたキャップ付きRNAをゼブラフィッシュ胚にマイクロインジェクションする方法があります。本デモンストレーションでは、EGFPタグ付き転写産物をマイクロインジェクションし、胚全体のGFP発現をライブで観察することで、インジェクションが成功したかどうかの可視的な指標として利用します。まず、目的の転写産物を用いてin vitro キャップRNA転写反応を行います。当研究室では通常、目的のcDNAをpCS2+ベクターに挿入し、mMESSAGE mMACHINE SP6キットを用いて大量のキャップ付きRNAのin vitro 合成反応を行います。次に、RNeasy Mini Kitを用いた精製、あるいはフェノール・クロロホルム抽出およびイソプロパノール沈殿によってRNAサンプルを精製します。RNA調製物の濃度を慎重に測定し、注射当日まで-80°Cで保存します。RNAサンプルを融解し、軽くボルテックスした後、短時間遠心して集液します。次に、滅菌水を用いて、フェノールレッドの最終濃度が0.025〜0.05%となる作業溶液を調製します。フェノールレッドは、胚への溶液注入を確認するための可視マーカーとして機能します。ここでは、0.05% phenol redを含む100 ng/µLのEGFP mRNA作業溶液を調製します。最後に、作業サンプルを氷上に保持し、RNAストックを-80 °Cに戻してください。このサンプルの注入準備ができ次第、morphoの調製に進んでください。モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的タンパク質の翻訳を阻害したり、pre-mRNAのスプライシングを修飾したりすることで、遺伝子発現を改変するために広く使用されています。ゼブラフィッシュにおけるモルフォリノは、遺伝子機能をノックダウンさせる強力な逆遺伝学ツールとして機能します。本手順では、pkd2の翻訳開始部位を標的としたモルフォオリゴをマイクロインジェクションします。通常、Gene Tools LLC社から入手した、目的の遺伝子用に特異的に設計された300 $\mu$Mのモルフォオリゴを使用します。次に、100 µLの滅菌水を加えて3 mMのストック溶液を作成し、溶液を分注して、注射当日に使用するまで-20 °Cで保存します。morino溶液を65 °Cで5分間加熱します。その後、直ちに氷上で急冷し、短時間遠心分離します。このステップにより、オリゴの二次構造が変性し、溶液が完全に溶解することが保証されます。次に、Morpho溶液を滅菌水で希釈し、最終濃度を0.025〜0.05%のphenol redとして、作動液を調製します。本デモンストレーションでは、0.5 millimolarのPKD2 Morphinoと0.05%のphenol redを含む作動液を調製します。作動液は室温で保持し、サンプルの注入準備が整った段階でマイクロピペットへの充填を行ってください。まず、注入に使用するマイクロピペットを作製します。これは、マイクロピペットプラーを用いてBOSケイ酸ガラスキャピラリーチューブを加熱・延伸させることで行います。ニードルを延伸させた後、少量の粘土または粘着テープを敷いたペトリ皿に保管します。次に、くさび形の溝が形成された3枚のXE three培地プレートに1.5%アガロースを流し込み、マイクロインジェクション用チャンバープレートを作成します。これにより、注入中に胚を容易に保持することができます。その後、アガロースチャンバープレートを凝固させ、使用するまで4°Cで保存します。マイクロピペットへの充填を開始します。解剖顕微鏡の50倍の倍率でわずかに確認できる程度の開口部を作るため、ピンセットまたは外科用カミソリで遠位端を切断します。次に、調製した作業液を2 µL分注入します。カバーガラスの上に滴下した溶液に対し、マイクロピペットの背面を、チューブ付き皮下注射針を装着した5 mLシリンジに接続し、マイクロピペットの先端をワーキングソリューションの液滴にわずかに浸します。この際、マイクロピペットのチップを破損させないよう注意してください。シリンジのプランジャーを引くことで、ワーキングソリューションをマイクロピペットの先端からサイフォンで吸引します。次に、マイクロピペットの注入量を校正します。マイクロメータースライドの上にミネラルオイルを1滴滴下し、圧力パルスマイクロインジェクター装置の電源とエアサプライをオンにします。続いて、マイクロピペットをマイクロインジェクター装置のマイクロピペットホルダーに取り付けます。マイクロインジェクターは圧力制御されており、解剖顕微鏡の下にあるフットペダルを押すことで注入が行われます。マイクロインジェクターを用いて、マイクロメーターオイルの上にワーキングソリューションを1滴滴下し、注入量を確認してください。オイルの上に球状に浮いた滴の直径を測定します。注入時間と圧力を調整し、注入量を慎重に校正してください。このステップは、マイクロインジェクション実験の再現性を高めるのに役立ちます。本デモンストレーションでは、すべてのマイクロインジェクションを液滴直径 0.15 millimeters で行います。最後に、注入量を校正したら、マイクロインジェクターのホールドノブを使用して、マイクロピペットの逆流や漏れを防ぎます。次に、ゼブラフィッシュの胚を準備します。ゼブラフィッシュはランダムに交配するため、準備を開始する毎朝の最初の数時間以内に、1細胞期の胚を回収し、1X E3培地に配置します。3 mLの転送ピペットを使用して、マイクロインジェクションチャンバープレートの楔形トラフに沿って胚を配置します。培地を除去し、胚が浸水しすぎず、浅く浸っている状態にします。この操作により、胚がトラフの底に沈降しやすくなり、またマイクロピペットによる卵膜（corion）の貫通が容易になります。それでは、注入を開始します。まず、解剖顕微鏡下で1細胞期胚の細胞質が見えるように、マイクロピペットを用いて胚を操作します。マイクロピペットのチップを破損させないよう注意しながら、まず卵膜を貫通し、次に卵黄を貫通させて胚に注入します。このデモンストレーションでは、まず細胞の直下の卵黄にマイクロインジェクションを行い、細胞質流と拡散によってワーキングソリューションを細胞内に導入します。ワーキングソリューションにフェノールレッドを添加しているため、この流れを視認することができます。これは単細胞胚であるため、フリーハンドまたはマニピュレーターを用いて注入することが可能です。また、細胞質への直接注入についても実演します。細胞への直接的なマイクロインジェクションはより確実な方法ですが、胚の適切な向きの調整とマイクロインジェクション技術が必要となるため、時間がかかります。細胞膜は卵黄膜よりも強固であるため、卵黄側からマイクロピペットを挿入して細胞に到達させる方が迅速に完了することが多くあります。動物極を溝の底に向け、震えない手で慎重に行うことが、この注入法において有効です。マイクロインジェクション後、胚をE3培地を入れたペトリ皿に移し、正常な発生を促すため28.5 °Cでインキュベートします。その後の数時間から数日間の胚発生過程において、目的の表現型が現れるか観察してください。マイクロインジェクションの成功を確認するため、シールド期からin vivo全胚蛍光顕微鏡を用いて、発生中の胚におけるGFPの発現をモニタリングします。コンストラクトの発現は胚発生の初期段階で最も強く、発生が進むにつれて減衰することが多くあります。これは、注入されたキャップ付きRNAが徐々に分解されるためであり、発現したタンパク質の安定性に依存します。既報の結果に基づき、PKD2モルフィノによって、PKD2変異ゼブラフィッシュに見られるような背側体軸の湾曲が再現され、受精後約2〜3日で腎嚢胞が出現することが期待されます。ゼブラフィッシュにおいて、mRNAの過剰発現およびモルフォリノオリゴヌクレオチドによる遺伝子ノックダウン研究を行うための、堅牢なマイクロインジェクション法について解説しました。この操作を行う際は、安定した手つきで注入することが重要である点に留意してください。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。

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JoVE Journal

Biology

生物学

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モルホリノオリゴヌクレオチドの脳室マイクロインジェクションを使用した大人のゼブラフィッシュ脳における遺伝子発現のマイクロマニピュレーション

そのような遺伝子特異モルホリノの脳室内注射を用いた組織再生などの開発および生理学的恒常性の後期段階の間に遺伝子機能を評価するためのゼブラフィッシュに適応逆遺伝学的方法。...

ゼブラフィッシュの幼虫の複数の困難な標的組織をトランスフェクションするために心室インジェクションを用いた遺伝子モルホリノアプローチを逆転

トランスジェニック蚊を取得するA.ネッタイシマカの胚のマイクロインジェクション

ここでは、長期的イメージング、二光子イメージングと組織損傷のテクニック、およびタイムラプス共焦点イメージングのためのゼブラフィッシュ胚を装着するための方法を説明します。...

ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

学ぶゼブラフィッシュ胚へのマイクロインジェクション技術。mRNA過剰発現とモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドによる遺伝子ノックダウンを実施し、発生生物学における遺伝子機能の理解を深める方法です。

ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

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