ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

この手順は、morphoおよびin vitro転写キャップmRNAを調製することから始まります。モルフォを含む溶液を吸い上げることによりマイクロピペットに充填し、マイクロメーターを使用して注入量を1セルステージで較正します。その後、ゼブラフィッシュの胚を採取し、卵黄マイクロ注射用のマイクロインジェクションチャンバーに整理します。

ワーキングソリューションは、細胞のすぐ下の卵黄に注入され、細胞質の動きを使用して細胞マイクロインジェクション用の溶液を運ぶために使用されます。注射後、溶液を細胞質に注入します。E 3つの培地で胚を摂氏28.5度でインキュベートし、その後の段階で関心のある表現型をスコアリングします。

こんにちは、研究室のシャイロ・ユエン、サーシャ博士の息子で、イェール大学医学部遺伝学部の学科です。本日は、ゼブラフィッシュにおけるmRNAの過剰発現およびモルフォオリゴヌクレオチド遺伝子ノックダウン研究を実施するための堅牢なマイクロインジェクション技術を実演します。当研究室では、この手法を用いて、嚢胞腎におけるS繊毛の役割について研究しています。

それでは始めましょう。遺伝子機能研究の強力なアプローチの1つは、ゼブラフィッシュの胚にin vitroで転写されたキャップ付きRNAをマイクロインジェクションすることです。このデモンストレーションでは、EGFPタグ付き転写産物をマイクロインジェクションし、生きた全胚GFP発現を目に見える読み出しとして使用して、インジェクションを成功させます。

まず、目的の転写産物に対してin vitro cap RNA転写反応を行います。当研究室では、PCの2プラスベクターに目的のA-C-D-N-Aを日常的に挿入し、M message M machine SP sixキットを用いて、キャップされた大量のRNAのin vitro合成反応を行っています。次に、RN Easy Mini Kitに通すか、フェノールクロロホルム抽出とイソプロパノール沈殿により、RNAサンプルを精製します。

RNA調製物の濃度を慎重に決定し、注射当日に使用できるようになるまで摂氏マイナス80度で保管してください。RNAサンプルを軽く解凍し、短時間スピンダウンします。次に、滅菌水と最終濃度が0.025〜0.05%のフェノールレッドで作業溶液を準備します。フェノールレッドは、胚への溶液の注入のための目に見えるマーカーとして機能します。

ここでは、0.05%フェノールレッドを含む1マイクロリットルEGFP mRNAあたり100ナノグラムの作業溶液を調製します。最後に、作業サンプルを氷上に保ち、RNAストックを摂氏マイナス80度に戻します。このサンプルを注入する準備ができたら、モルフォの準備に進みます。

モリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的タンパク質の翻訳をブロックしたり、prem NAを修飾したりすることにより、遺伝子発現を改変するために広く使用されています。ゼブラフィッシュの形態のスプライシングは、遺伝子機能をノックダウンすることにより、強力な逆遺伝学ツールとして機能します。ここでは、pkd twoの翻訳開始部位を標的としたmorphオリゴをマイクロインジェクします。私たちは、gene tools LLCから取得した目的の遺伝子用に特別に設計された300 Mのモルフオリゴを日常的に使用しています。

その後、100マイクロリットルの滅菌水を加えて3ミリモルの原液を作り、その溶液を分注して、注射当日に使用できるようになるまでマイナス20°Cで保存します。モリノ溶液を摂氏65度で5分間加熱します。次に、溶液を氷上ですぐに冷却し、短時間回転させます。このステップにより、オリゴの二次構造が変性し、溶液が完全に可溶化されます。

次に、モルフォ溶液を滅菌水で希釈し、最終濃度を0.025〜0.05%ピナールレッドに希釈して、作業溶液を調製します。このデモンストレーションでは、0.5ミリモルPKD2モリノと0.05%フェノールレッドの作業溶液を準備します。作業溶液を室温に保ち、このサンプルを注入する準備ができたらマイクロピペット充填に進みます。

まず、注射に使用するマイクロピペットを製作する必要があります。これは、マイクロピペット極性デバイス内でBOSケイ酸塩ガラスキャピラリーチューブを加熱して引っ張ることによって行われます。針を引っ張った後、少量の粘土または粘着テープテープの上にあるペトリ皿に保管されます。

次に、くさび形のトラフで成形された1つのXE 3つの中プレートに1.5%arosを注いでマイクロインジェクションチャンバープレートを調製します。これは、注入中に胚を保持するための簡単な方法として機能します。その後、アグロチャンバープレートを固化させ、使用する準備ができるまで摂氏4度で保管します。

マイクロピペットへの充填を開始します。鉗子または外科用カミソリの刃で遠位端を切断し、50倍の倍率で解剖顕微鏡で見えるだけの開口部を作ります。次に、作業溶液の2マイクロリットルを配置します。

カバースリップに滴下するように、マイクロピペットの背面を皮下注射針にチューブを取り付けた5ミリリットルのシリンジに取り付け、マイクロピペットの遠位先端を作業溶液の滴にわずかに沈めます。マイクロピペットの先端を折らないように注意してください。シリンジのプランジャーを引っ張ることにより、マイクロピペットの遠位端から作業溶液をサイフォンします。

次に、マイクロピペットの注入量をキャリブレーションします。マイクロメータースライドに鉱油を一滴垂らし、圧力パルスマイクロインジェクター装置への電源と空気供給をオンにします。次に、マイクロピペットをマイクロインジェクター装置のマイクロピペットホルダーに取り付けます。

マイクロインジェクターは圧力調整されており、解剖顕微鏡の下でフットペダルを踏むことで排出物が作動します。マイクロインジェクターを使用して注入量をテストし、作業溶液をマイクロメーターオイルに一滴垂らします。液滴が油の上に球体として浮かぶときの水滴の直径を測定します。

注入時間と圧力を調整して、注入量を慎重に調整します。このステップは、マイクロインジェクション実験の再現性に役立ちます。このデモンストレーションでは、すべてのマイクロインジェクションを0.15mmの液滴径で行います。

最後に、注入量のキャリブレーションが完了したら、マイクロインジェクターのホールドノブを使用して、マイクロピペットの逆充填と漏れを防ぎます。次に、ゼブラフィッシュの胚を準備します。ゼブラフィッシュは、毎朝最初の数時間でランダムに交尾し、準備を開始し、1つの細胞段階で胚を収集し、それらを1つのXE3培地に配置します。

3ミリリットルのトランスファーピペットを使用して、マイクロインジェクションチャンバープレートのくさび形のトラフに沿って胚を配置します。胚が浅く、水没し、浸水しないように培地を取り出します。このステップは、胚をトラフの底に沈殿させるだけでなく、マイクロピペットによるコリオンの浸透にも役立ちます。

それでは、注射を始めます。まず、マイクロピペットで胚を操作して、1つの細胞段階の胚の細胞質が解剖顕微鏡で見えるようにします。マイクロピペットの先端を折らないように注意し、マイクロピペットでコリオンを貫通し、次に卵黄を貫通して胚に注入します。

このデモンストレーションでは、まず細胞の真下の卵黄にマイクロインジェクションを行い、細胞質と拡散によって作業溶液を細胞内に取り込むことができます。この流れは、作業溶液にフェノールレッドが添加されているため、目に見えます。これは単一細胞胚であるため、フリーハンドまたはマニピュレーターを使用して注入できます。

また、細胞質への直接注入のデモンストレーションも行います。細胞への直接マイクロインジェクションはより堅牢ですが、適切な胚の配向とマイクロインジェクション技術が必要なため、時間がかかります。細胞膜は卵黄膜よりも厳密であるため、卵黄を通ってマイクロピペットに入り、細胞に到達する方が速いことがよくあります。

細胞質が動物の極をトラフの底に向け、安定した手で作業することは、この注入方法に役立つ可能性があります。マイクロインジェクション後、胚をE 3培地の入ったシャーレに置き、正常な発生のために摂氏28.5度でインキュベートします。胚発生の次の数時間から数日にわたって、関心のある表現型の胚を観察します。

マイクロインジェクションの成功を検証するために、シールド段階から始まる発生中の胚でのGFPの発現を監視します in vivo全胚蛍光顕微鏡法による構築物の発現は、胚発生の初期イベント中に最も強く、発生中にしばしば減少します。注入されたキャップ付きRNAは徐々に分解され、発現したタンパク質の安定性に依存します。以前に発表された結果に基づいて、PKD 2 モルヒネは、PKD 2 変異ゼブラフィッシュに見られる背側体軸の湾曲を模倣し、受精後約 2 〜 3 日で腎嚢胞を呈すると予想しています。

ブラフィッシュでmRNAの過剰発現とモルフォオリゴヌクレオチド遺伝子のノックダウン研究を行うための堅牢なマイクロインジェクション技術を紹介しました。この手順を行う際には、それが重要であることを忘れないでください。安定した手で注入します。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。